曲 穎宗 蕾沈 鐳王 燕徐銘益劉 梅竇愛霞陸倫根#

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科1（200080）

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所2

肝蘇是中藥扯根菜的成方制劑，具有清熱利濕、解毒活血、平肝健脾等作用，對黃疸性肝病、慢性病毒性肝炎等慢性肝病有一定治療作用[1,2]。本課題組的前期研究[3]發(fā)現(xiàn)肝蘇可促進(jìn)人肝細(xì)胞增殖，保護(hù)肝細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC）免受氧化應(yīng)激損傷，且可抑制HSC分泌透明質(zhì)酸（HA）、層黏連蛋白（LN）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），提示其具有肝細(xì)胞保護(hù)、抗氧化、抗肝纖維化作用。本研究以四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，旨在觀察肝蘇對實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的防治作用并進(jìn)一步探討其中的機(jī)制，為肝蘇臨床應(yīng)用于抗肝纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器

健康雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠 63只，體質(zhì)量約220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物科學(xué)部。所有動物自由進(jìn)食、飲水，溫度、濕度符合標(biāo)準(zhǔn)，明暗12 h/12 h循環(huán)。

肝蘇無糖型顆粒（四川古藺肝蘇藥業(yè)有限公司），3 g/袋，相當(dāng)于16.7 g生藥，分別以蒸餾水配制成濃 度為 0.1 g/ml、0.2 g/ml、0.4 g/ml 的 溶液 。ALT試劑盒購自上海羅氏制藥有限公司，AST試劑盒購自上海北加生化試劑有限公司，ALP試劑盒購自上?？迫A生物工程股份有限公司，血清HA檢測試劑盒購自Gentaur公司，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體、Ⅰ型膠原抗體、Ⅲ型膠原抗體購自Abcam公司，免疫組化二抗和DAB試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

ADVIA 1650全自動生化分析儀購自Bayer公司，Mat-3000酶標(biāo)儀購自DRG公司，Ultraspec 2000型紫外/可見分光光度計購自Pharmacia Biotech公司。

二、動物分組和模型制備

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分成5組，分別為正常對照組（7只）、肝纖維化模型組（14只）、低劑量肝蘇干預(yù)組（1 g/kg，14只）、中劑量肝蘇干預(yù)組（2 g/kg，14 只）、高劑量肝蘇干預(yù)組（4 g/kg，14只）。后四組大鼠先予皮下注射40%CCl4溶液（純橄欖油配制）0.5 ml/100 g，隨后予0.2 ml/100 g，2次/周×8周，建立大鼠肝纖維化模型[4]。正常對照組予相同劑量橄欖油皮下注射。肝蘇干預(yù)組于建模同時予相應(yīng)劑量肝蘇溶液灌胃，正常對照組和肝纖維化模型組予相同劑量飲用水灌胃，1次/d×8周。

每周記錄大鼠體質(zhì)量，觀察精神狀態(tài)、活動情況、皮毛光澤度等。

實(shí)驗(yàn)過程中，低、中、高劑量肝蘇干預(yù)組分別有4、2、4只大鼠因灌胃溶液嗆入氣管而死亡。8周末，動物于麻醉狀態(tài)下抽取下腔靜脈血5 ml，貼壁注入試管，室溫靜置 3 h，2500×g離心 10 min，吸取上清液待檢。處死動物，稱量肝濕重后留取肝組織待檢。

三、血清學(xué)指標(biāo)檢測

取 0.5 ml血清送檢驗(yàn)科行 ALT、AST、ALP等血清肝生化指標(biāo)檢測。另取200μl血清行HA檢測，酶標(biāo)儀450 nm處讀取數(shù)據(jù)。

四、肝組織MDA和SOD檢測

按試劑盒說明書檢測肝組織MDA含量和SOD活性。

五、組織病理學(xué)檢查

取大鼠肝組織，4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度[5]。

六、免疫組化染色檢測肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，行抗原修復(fù)，封閉。分別滴加α-SMA抗體（工作濃度1∶500）、Ⅰ型膠原抗體（工作濃度1∶400）、Ⅲ型膠原抗體（工作濃度 1∶500），4 ℃過夜。PBS沖洗，二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。以已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

結(jié)果判斷：以細(xì)胞質(zhì)（α-SMA）或纖維（Ⅰ型、Ⅲ型膠原）呈棕黃色為陽性。隨機(jī)選取10個高倍視野（×400），Image-Pro Plus 6.0 軟件計算陽性染色面積占整個視野面積的百分比，取均值。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s 表示，檢驗(yàn)方差齊性，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，肝纖維化分期半定量資料的比較采用多樣本比較的秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis檢驗(yàn)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組大鼠基本情況比較

正常對照組大鼠生長狀況良好，肝纖維化模型組大鼠一般情況差，精神萎靡，皮毛光澤度欠佳，體質(zhì)量增長速度明顯減慢，肝指數(shù)（肝濕重/體質(zhì)量×100%）明顯升高。各劑量肝蘇干預(yù)組大鼠體質(zhì)量增長較正常對照組稍緩慢，肝指數(shù)亦明顯升高，干預(yù)組與模型組間體質(zhì)量增加值和肝指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。

表1 各組大鼠基本情況和血清學(xué)指標(biāo)比較（±s ）

表1 各組大鼠基本情況和血清學(xué)指標(biāo)比較（±s ）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 肝指數(shù)（%） ALT（U/L） AST（U/L） ALP（U/L） HA（ng/ml）正常對照組 3.72±0.21 54.71±6.78 103.00±9.27 203.86±35.25 38.50±9.39肝纖維化模型組 5.80±0.66* 811.09±475.96* 1791.17±528.19* 545.18±173.04* 330.58±160.62*肝蘇干預(yù)組低劑量5.60±0.69* 462.71±460.49* 534.67±501.89# 420.89±143.90* 171.58±74.68*#中劑量 5.36±0.58* 527.50±359.95* 934.00±598.56*# 346.75±166.50*# 122.41±108.62#高劑量 5.78±0.65* 363.00±270.62# 523.33±853.83# 309.11±65.78# 116.00±83.59#例數(shù)7 14體質(zhì)量增加（g）167.4±26.1 87.4±34.0*10 12 10 110.1±34.0*98.2±40.9*97.6±28.6*

二、各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)比較

肝纖維化模型組血清 ALT、AST、ALP、HA水平較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。高劑量肝蘇干預(yù)組血清ALT水平、高、中劑量肝蘇干預(yù)組血清ALP水平、各劑量肝蘇干預(yù)組血清AST、HA水平較肝纖維化模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表 1）。

三、各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較

肝纖維化模型組肝組織MDA含量較正常對照組顯著升高（P＜0.05）。各劑量肝蘇干預(yù)組均較肝纖維化模型組下降，高、中劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組間肝組織SOD活性無明顯差異（見表 2）。

表2 各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較（±s ）

表2 各組大鼠肝組織MDA含量和SOD活性比較（±s ）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 例數(shù) MDA（nmol/mg蛋白） SOD（U/mg蛋白）正常對照組 7 1.13±0.13 124.85±15.83肝纖維化模型組 14 2.07±0.43* 115.34±21.43肝蘇干預(yù)組低劑量 10 1.77±0.33* 98.42±11.06中劑量 12 1.33±0.34# 116.10±29.04高劑量 10 1.26±0.13# 116.38±20.79

四、各組大鼠肝纖維化程度比較

各組大鼠肝組織HE和Masson染色均可見纖維組織（見圖1、圖2）。正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無肝細(xì)胞脂肪變性或壞死，無炎癥細(xì)胞浸潤和纖維組織增生。肝纖維化模型組肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，小葉周圍肝細(xì)胞明顯壞死，纖維組織增生、假小葉形成，肝細(xì)胞明顯腫脹變性，尤以脂肪變性為甚，部分肝細(xì)胞可見氣球樣變。各劑量肝蘇干預(yù)組肝組織未見明顯假小葉，僅少量纖維組織增生，多局限于門管區(qū)，肝細(xì)胞以脂肪變性、壞死為主。

圖1 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（HE染色，×100）

各組大鼠肝纖維化分期比較示Kruskal-Wallis檢驗(yàn)H值為8.370，組間總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.039）。各劑量肝蘇干預(yù)組纖維化分期均較肝纖維化模型組明顯改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），尤以高劑量組為著（見表 3）。

圖2 各組大鼠肝組織纖維化程度比較（Masson染色，×100）

表3 各組大鼠肝纖維化分期比較（n）

五、各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量比較

免疫組化染色示正常對照組α-SMA僅表達(dá)于小動脈、小靜脈血管上皮細(xì)胞胞質(zhì)。肝纖維化模型組α-SMA大量表達(dá)于門管區(qū)、纖維間隔的HSC胞質(zhì)，染色面積較正常對照組顯著增多（P＜0.05）。各劑量肝蘇干預(yù)組α-SMA主要表達(dá)于門管周圍散在分布的HSC胞質(zhì)，染色面積較肝纖維化模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖 3、表 4）。

圖3 各組大鼠肝組織α-SMA免疫組化染色圖（×100）

圖4 各組大鼠肝組織Ⅰ型膠原免疫組化染色圖（×100）

免疫組化染色示正常對照組肝組織Ⅰ型膠原主要表達(dá)于中央靜脈、門管區(qū)、門管間纖維組織，Ⅲ型膠原除上述區(qū)域外，尚表達(dá)于竇周。肝纖維化模型組Ⅰ型、Ⅲ型膠原除表達(dá)于中央靜脈、門管區(qū)、竇周外，尚沿纖維間隔彌漫分布，染色面積均較正常對照組顯著增多（P<0.05）。各劑量肝蘇干預(yù)組Ⅰ型、Ⅲ型膠原主要表達(dá)于中央小葉和門管周圍，少量表達(dá)于纖維間隔，染色面積較肝纖維化模型組明顯減少，Ⅰ型膠原各劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），Ⅲ型膠原僅高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（見圖 4、圖 5、表 4）。

圖5 各組大鼠肝組織Ⅲ型膠原免疫組化染色圖（×100）

表4 各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原染色面積比較（±s，%）

表4 各組大鼠肝組織α-SMA、Ⅰ型、Ⅲ型膠原染色面積比較（±s，%）

*與正常對照組比較，P＜0.05；#與肝纖維化模型組比較，P＜0.05

組 別 例數(shù) α-SMA Ⅰ型膠原 Ⅲ型膠原正常對照組 7 1.08±0.53 0.64±0.21 0.72±0.34肝纖維化模型組 14 9.48±2.51* 8.29±2.86* 5.21±1.56*肝蘇干預(yù)組低劑量 10 5.64±1.93*#4.22±1.40*#4.26±1.61*中劑量 12 4.59±2.26*#3.16±1.18*#4.12±1.53*高劑量 10 3.87±1.66*#2.70±0.92*#3.59±1.70*#

討 論

肝纖維化是諸多肝病的中間環(huán)節(jié)，如不予有效治療，可最終進(jìn)展為肝硬化，甚至肝癌、肝衰竭。當(dāng)前觀點(diǎn)認(rèn)為肝纖維化進(jìn)程可逆，預(yù)防和治療肝纖維化是肝病防治的重要環(huán)節(jié)[6,7]。CCl4為選擇性肝毒性藥物，可致肝小葉中央靜脈周圍細(xì)胞壞死、纖維增生，CCl4大鼠肝纖維化模型是目前國內(nèi)外較常采用的動物模型之一，適用于肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的動態(tài)觀察和研究[8 ～ 10]。本研究結(jié)果證實(shí)CCl4可成功誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，模型大鼠血清ALT、AST、ALP水平較正常對照組顯著升高，提示存在明顯肝細(xì)胞損傷。

肝蘇為中藥扯根菜的成方制劑，包括槲皮素、沒食子酸、喬松素等成分。Molina等[11]的研究顯示槲皮素可通過直接抑制脂質(zhì)過氧化、間接促進(jìn)抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）的產(chǎn)生以保護(hù)小鼠肝臟免受氧化應(yīng)激損傷。Renugadevi等[12]的研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能緩解鎘所致的大鼠腎毒性和氧化應(yīng)激損傷。Liu等[13]的研究亦證實(shí)槲皮素可恢復(fù)抗氧化酶活性，減少氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞凋亡。此外，有研究[14,15]發(fā)現(xiàn)沒食子酸可激活肝微粒體谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶活性，防止自由基對肝細(xì)胞微粒體的損傷。上述研究提示肝蘇在保護(hù)肝細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷方面有一定應(yīng)用前景。本研究結(jié)果示各劑量肝蘇干預(yù)組血清ALT、AST、ALP水平均有不同程度的改善，提示肝蘇可通過抗氧化作用減輕肝細(xì)胞壞死，從而保護(hù)肝細(xì)胞，改善肝功能。

CCl4大鼠肝纖維化模型研究提示肝內(nèi)脂肪本身與HSC的活化和膠原生成無關(guān)，但可通過增強(qiáng)CCl4對肝臟的脂質(zhì)過氧化損傷促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。MDA是脂質(zhì)過氧化的重要終產(chǎn)物之一，可反映機(jī)體受氧自由基攻擊的嚴(yán)重程度，SOD則反映機(jī)體清除氧自由基的能力，兩者與HSC增殖和肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[16]。本研究結(jié)果示高、中劑量肝蘇干預(yù)組肝組織MDA含量顯著下降，但各組間SOD活性無明顯差異，提示肝蘇可能通過直接降低MDA含量以延緩肝纖維化的發(fā)生，此過程不伴SOD活性的改變。

肝纖維化由細(xì)胞外基質(zhì)過度增生并在肝內(nèi)異常沉積所致，膠原纖維是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原合成、沉積與降解、吸收間動態(tài)平衡的破壞是造成肝纖維化的主要原因[17,18]。Ⅰ型、Ⅲ型膠原占總膠原含量的80% ～ 90%[19]，因此觀察兩者的變化可間接評價肝纖維化程度，亦可用于藥物抗肝纖維化療效的評估。本研究結(jié)果示各劑量肝蘇干預(yù)組Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量均較肝纖維化模型組有所下降，與肝組織病理學(xué)檢查纖維化分期結(jié)果一致，Ⅰ型膠原含量在各劑量干預(yù)組中均顯著下降，Ⅲ型膠原含量僅在高劑量干預(yù)組中顯著下降，由此提示肝蘇可明顯改善大鼠肝纖維化，尤以高劑量組作用為著。此外，本研究結(jié)果示各劑量肝蘇干預(yù)組血清纖維化指標(biāo)HA水平均較肝纖維化模型組顯著下降，與肝組織病理學(xué)和Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量檢查結(jié)果一致。

HSC活化和增殖是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[20,21]。肝細(xì)胞損傷可激活HSC，使其由靜息狀態(tài)活化為肌纖維樣母細(xì)胞，表達(dá)活化標(biāo)記物α-SMA，并大量合成細(xì)胞外基質(zhì)。本研究結(jié)果示肝纖維化模型組肝組織大量表達(dá)α-SMA，提示HSC活化；各劑量肝蘇干預(yù)組α-SMA含量顯著減少，即活化的HSC減少，由此提示肝蘇可能通過抑制HSC活化以減少膠原沉積，改善肝纖維化，并進(jìn)一步提示抑制HSC活化有望成為延緩肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上所述，本研究結(jié)果示肝蘇能減輕實(shí)驗(yàn)性大鼠肝纖維化的肝細(xì)胞損傷，降低肝組織MDA含量，抑制HSC活化和肝內(nèi)膠原合成，具有抗氧化和抗纖維化作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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