何睿林，梁寧生(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，南寧市530021)

對于抗菌多肽(Antimicrobial peptides)的研究已有較長的歷史，這類多肽對細(xì)菌和/或真菌都有殺菌作用。最初的研究主要集中在生物體內(nèi)天然存在的抗菌多肽，無論是低等生物昆蟲體內(nèi)，還是高等生物哺乳動(dòng)物體內(nèi)，都存在這類物質(zhì)，其是生物天然免疫系統(tǒng)里一類抵抗微生物感染的重要武器[1]。對抗菌多肽的研究有助于揭示生物抵抗感染的機(jī)制，也有助于抗感染藥物的開發(fā)。

目前，除生物體內(nèi)天然存在的抗菌多肽以外，抗菌多肽的研究還向2方面擴(kuò)展:一是根據(jù)抗菌多肽的一些特性，利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和合成具有抗菌作用的多肽(非天然的)[2]；二是根據(jù)已知的一些蛋白分子結(jié)構(gòu)，如血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)，模擬合成這些分子的部分結(jié)構(gòu)，也就是一些多肽片段，其也具有殺菌作用[3]。本研究是根據(jù)人ⅡA型磷脂酶A2(ⅡA型PLA2)分子的結(jié)構(gòu)(全長為124個(gè)氨基酸殘基)，合成其碳(C)末端26個(gè)氨基酸殘基的多肽C-26?，F(xiàn)對其殺菌作用進(jìn)行初步研究。

1 材料

1.1 細(xì)菌

3種革蘭陽性(G+)細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(ATCC26003)、枯草桿菌(ATCC63501)、炭疽桿菌(ATCC63065)，3種革蘭陰性(G－)細(xì)菌:大腸桿菌(ATCC44113)、變形桿菌(ATCC49027)、綠膿桿菌(ATCC10104)，以上標(biāo)準(zhǔn)菌株均由廣西醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 試藥

多肽C-26(由梁寧生教授設(shè)計(jì)，上海波泰生物公司合成和純化，批號:10101321)；羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)、1%小牛血清白蛋白(北京Solarbio公司)；LB培養(yǎng)基粉(上海生工生物工程有限公司)；LB營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；無水氯化鈣(CaCl2，成都科隆化工試劑廠生產(chǎn)，批號:20081106)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco-Brl公司)。

1.3 儀器

Anke TGL-16C臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；TU-1810S紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；Thermo 420型恒溫氣浴搖床(新加坡Thermo Electron公司)；HWS-20恒溫水浴箱(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；J3-NAPCO-5410型CO2培養(yǎng)箱(克勒格瓦尼(上海)分析儀器有限公司)。

2 方法

2.1 不同哺乳動(dòng)物ⅡA型PLA2氨基酸順序(蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu))的獲取與分析

根據(jù)本課題組先前的研究結(jié)果獲取兔ⅡA型PLA2氨基酸順序[4]，并利用美國國家生物工程信息中心(NCBI)網(wǎng)站的基因庫(GenBank)，查詢并獲取所有已知的包括人、猩猩、猴、牛、豚鼠、大鼠和小鼠等7種哺乳動(dòng)物的ⅡA型PLA2mRNA及其氨基酸順序。人、猩猩、猴和牛的ⅡA型PLA2mRNA參考序列號(NCBI reference sequence)分別是NM_000300.3、XM_001160501.1、XM_001094969.1、NM_001025324，豚鼠、大鼠和小鼠ⅡA型PLA2mRNA基因獲取號分別是GI:951010、GI:155369735、GI:132626632。同時(shí)，將各自氨基酸順序的C末端26個(gè)氨基酸殘基剪切并比較其氨基酸組成情況。

2.2 多肽C-26的制備與配制

以上述獲取的人ⅡA型PLA2氨基酸順序的C末端為模板，合成長度為26個(gè)氨基酸殘基的多肽C-26(ARNKTTYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC)，純度90%。多肽C-26使用前先離心將附壁的制劑粉末收集至管底以確保溶質(zhì)的量，然后溶于經(jīng)高壓蒸汽滅菌的雙蒸水400μL(10 g·L－1)，并以20μL/管分裝于500μL Eppendorf管中，－20℃冷凍保存，盡量避免反復(fù)凍融。

2.3 殺菌試驗(yàn)

采用瓊脂鋪板計(jì)數(shù)法。(1)取過夜培養(yǎng)的細(xì)菌，按1∶50分別加入至5 mL新鮮LB培養(yǎng)液中(當(dāng)細(xì)菌為金黃色葡萄球菌或綠膿桿菌時(shí)，加入量為300μL)，置于37℃恒溫氣浴搖床中振搖孵育2.5～3 h(對數(shù)生長期)。(2)采用臺式離心機(jī)離心收集、洗滌細(xì)菌并將其沉淀物溶解于0.5 mL生理鹽水，繼以紫外分光光度計(jì)(波長540 nm)測出吸光度達(dá)到0.1時(shí)所需的細(xì)菌量(mL)，計(jì)算細(xì)菌稀釋倍數(shù)。吸取多肽C-26和細(xì)菌(終濃度1×109cfu·L－1)各10μL，加入RPMI-1640反應(yīng)體系(總體積為100μL，含有10 mol·L－1Hepes、1%小牛血清白蛋白、1 mol·L－1CaCl2，pH 7.4)，混勻后置于37℃恒溫水浴。(3)水浴2 h后，從該體系中取出反應(yīng)液50 μL，加滅菌生理鹽水450 μL，連續(xù)10倍稀釋，共4次。每一稀釋倍數(shù)都取出100 μL的稀釋液至無菌培養(yǎng)皿(直徑55 mm)中，再加入經(jīng)高壓蒸汽滅菌后55℃保溫的LB營養(yǎng)瓊脂約5 mL，待瓊脂冷卻后，將培養(yǎng)皿放入37℃溫箱培養(yǎng)。18～24 h后取出計(jì)算每一瓊脂板上的菌落形成單位(cfu)，與未加入多肽C-26的對照組相比，計(jì)算經(jīng)不同濃度多肽C-26作用后的殺菌率＝(對照組cfu－實(shí)驗(yàn)組cfu)/對照組cfu×100%，并繪制殺菌曲線。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

3 結(jié)果

3.1 不同哺乳動(dòng)物ⅡA型PLA2蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)C末端分析

對獲得的包括人、猩猩、猴、牛、兔、豚鼠、大鼠和小鼠等8種哺乳動(dòng)物ⅡA型PLA2蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析表明，在其中的C末端26個(gè)氨基酸殘基堿性最強(qiáng)，完全不含酸性氨基酸殘基，卻包含5～8個(gè)堿性氨基酸殘基。所帶的凈正電荷在+5～+8之間，堿性氨基酸殘基占據(jù)C末端26個(gè)氨基酸殘基的百分比在19.23%～30.7%，提示該區(qū)域?yàn)閴A性氨基酸富集區(qū)域。人或動(dòng)物ⅡA型PLA2C末端26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成情況見圖1。

3.2 多肽C-26對G+細(xì)菌的殺菌作用

多肽C-26在濃度為250 mg·L－1時(shí)即對同屬G+細(xì)菌的金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草桿菌具有較強(qiáng)的殺菌作用，殺菌率在70%～99.9%，殺菌敏感性由高到低依次為:枯草桿菌＞炭疽桿菌＞金黃色葡萄球菌；當(dāng)其濃度為500 mg·L－1(對炭疽桿菌)和1000 mg·L－1(對金黃色葡萄球菌)時(shí)，對炭疽桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌率增加至99.9%以上。多肽C-26對G+細(xì)菌的殺菌作用詳見圖2。

3.3 多肽C-26對G－細(xì)菌的殺菌作用

多肽C-26濃度在500 mg·L－1時(shí)，對大腸桿菌、變形桿菌和綠膿桿菌3種G－細(xì)菌的殺菌率較為接近，在41%～52%之間，殺菌敏感性由高到低依次為:變形桿菌＞綠膿桿菌＞大腸桿菌。多肽C-26對G－細(xì)菌的殺菌作用詳見圖3。

4 討論

4.1 多肽C-26的設(shè)計(jì)

已知的絕大部分抗菌多肽在結(jié)構(gòu)上有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是帶凈正電荷，在多肽分子的組成中有較多的堿性氨基酸殘基，較少或者沒有酸性氨基酸殘基[1]。本課題組先前對人ⅡA型PLA2的研究已注意到，ⅡA型PLA2分子組成中，也帶有較多堿性氨基酸殘基，所以分子帶較多的凈正電荷，其殺菌作用強(qiáng)度與分子攜帶的凈正電荷成正相關(guān)[4]。因此，本研究以人ⅡA型PLA2為模板，分析其結(jié)構(gòu)，選擇ⅡA型PLA2分子中堿性最強(qiáng)的多肽片段。在ⅡA型PLA2分子的C末端，有1段長度為26個(gè)氨基酸殘基的片段，約占模板分子1/5的長度，符合這一條件。其中，有8個(gè)堿性氨基酸殘基，而沒有任何酸性的，這一片段在已知的其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)也高度保留，特別是其攜帶較多凈正電荷的特性。另外，在ⅡA型PLA2分子的結(jié)構(gòu)中，這一片段沒有較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，如α-螺旋或者β-片層結(jié)構(gòu)，也較適合作為一個(gè)簡單多肽合成。因此，本研究選擇這一片段進(jìn)行合成，并檢測其殺菌作用。有學(xué)者曾根據(jù)蛇毒PLA2分子的C末端區(qū)域部分氨基酸順序合成了抗菌多肽(長度為13個(gè)氨基酸殘基)并進(jìn)行研究，但考慮到蛇毒PLA2分子殺菌作用比人ⅡA型PLA2分子低1000倍以上[5]，且蛇毒PLA2分子的結(jié)構(gòu)與人的有很大差別，作為藥物很有可能產(chǎn)生抗原性，故選擇人ⅡA型PLA2分子作為模板可能更為恰當(dāng)。

4.2 多肽C-26的殺菌作用

本研究結(jié)果表明，多肽C-26對試驗(yàn)的G+細(xì)菌有較強(qiáng)的殺菌作用，其殺滅99.9%細(xì)菌的多肽濃度在250～1000 mg·L－1之間；對3種G－細(xì)菌的殺菌作用比較弱，當(dāng)其濃度在500 mg·L－1時(shí)對三者的殺菌率相差不大，為41%～52%。之前本課題組對ⅡA型PLA2殺菌作用的研究表明，該分子對G+細(xì)菌有很強(qiáng)的殺菌作用，對G－細(xì)菌則很弱[4，6，7]。這提示多肽C-26與ⅡA型PLA2結(jié)構(gòu)具有的類似性，決定了其殺菌作用的類似，因此其應(yīng)該具有類似的殺菌機(jī)制。但是，本研究也注意到，多肽C-26的殺菌作用比ⅡA型PLA2分子明顯偏弱，具體原因值得進(jìn)一步探索。

4.3 多肽C-26的殺菌機(jī)制

前面提到，已知的絕大部分抗菌多肽在結(jié)構(gòu)上有一個(gè)共同點(diǎn)，那就是有較多堿性氨基酸殘基，分子帶凈正電荷。而在殺菌機(jī)制上，也與這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)密切相關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞膜外層和內(nèi)層都含有大量的酸性磷脂，如心磷脂和磷酸甘油，使得細(xì)菌的細(xì)胞膜帶有大量負(fù)電荷，那些帶有正電荷的抗菌多肽通過電荷的吸引力，結(jié)合到細(xì)菌的胞膜表面，進(jìn)而插入細(xì)胞膜內(nèi)層，使胞膜變薄和損壞，引起細(xì)菌死亡。由于高等生物是由真核細(xì)胞組成，而真核細(xì)胞的細(xì)胞膜的外層主要由不帶電荷的中性磷脂組成，使得這類抗菌多肽不能有效地結(jié)合到真核細(xì)胞膜上，故對人等高等生物沒有危害[1]。本課題組對ⅡA型PLA2的殺菌機(jī)制進(jìn)行過研究，也發(fā)現(xiàn)其與抗菌多肽有類似的機(jī)制[8，9]。雖然本文尚未對多肽C-26的殺菌機(jī)制進(jìn)行研究，但根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，推測其應(yīng)該也具有與其他抗菌多肽類似的殺菌機(jī)制，而具體的情況還有待進(jìn)一步的分析。

[1]Wiesner J，Vilcinskas A.Antimicrobial peptides:the ancient arm of the human immune system[J].Virulence，2010，1(5):440.

[2]Tian ZG，Dong TT，Teng D，et al.Design and characterization of novel hybrid peptides from LFB15(W4，10)，HP(2-20)，and cecropin A based on structure parameters by computer-aided method[J].Appl Microbiol Biotechnol，2009，82(6):1097.

[3]Catiau L，Traisnel J，Delval-Dubois V，et al.Minimal antimicrobialpeptidicsequencefromhemoglobinalpha-chain:KYR[J].Peptides，2011，32(4):633.

[4]梁寧生，楊帆，陸益，等.具強(qiáng)殺菌活性的兔Ⅱ型磷脂酶A2互補(bǔ)DNA克隆及其順序確定的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16(3):237.

[5]Paramo L，Lomonte B，Pizarro-Cerda J，et al.Bactericidal activity of Lys49 and Asp49 myotoxic phospholipases A2from Bothrops asper snake venom--synthetic Lys49 myotoxinⅡ-(115-129)-peptide identifies its bactericidal region[J].Eur J Biochem，1998，253(2):452.

[6]Weinrauch Y，Abad C，Liang NS，et al.Mobilization of potent plasma bactericidal activity during systemic bacterial challenge.Role of groupⅡA phospholipase A2[J].J Clin Invest，1998，102(3):633.

[7]李艷，梁寧生，陸益，等.不同生長時(shí)期的金黃色葡萄球菌對重組人血小板型磷脂酶A2的敏感性研究[J].中國藥房，2009，20(25):1945.

[8]Koprivnjak T，Peschel A，Gelb MH，et al.Role of charge properties of bacterial envelope in bactericidal action of human groupⅡA phospholipase A2 against Staphylococcus aureus[J].J Biol Chem，2002，277(49):47636.

[9]李艷，梁寧生，楊帆，等.重組人血小板型磷脂酶A2體外抗金黃色葡萄球菌的活性及其影響因素研究[J].中國藥房，2008，19(28):2177.