左麗麗，王振宇，2＊，樊梓鸞，田雙起

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，化學(xué)工程與技術(shù)，哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

隨著人們生活節(jié)奏的加快和膳食結(jié)構(gòu)的提高，受到電離輻射、紫外線、食品農(nóng)藥殘留等外界環(huán)境的影響越來越嚴(yán)重，由此產(chǎn)生了一系列的疾病，例如心臟病、癌癥、心腦血管疾病、炎癥、糖尿病、組織器官老化等等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，這些疾病的發(fā)生都與過剩的活性氧自由基有關(guān)［1］。又據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界現(xiàn)有760萬人死于癌癥，1500萬人死于心腦血管疾病，預(yù)計(jì)到2020年，死亡人數(shù)將較現(xiàn)在增加50%左右?？梢?，人類的健康面臨很大的威脅。許多研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物能夠清除60%以上的自由基。植物多酚是多羥基類化合物的總稱，廣泛存在于植物體內(nèi)，主要存在于植物的根、莖、葉、果實(shí)、表皮中，在自然界儲(chǔ)量非常豐富［2］。

水果、蔬菜和茶中含有各種各樣的抗氧化劑，包括多酚類化合物和維生素，多酚類化合物例如花色苷、黃酮、黃烷醇以及單寧酸等等。研究較多的多酚有茶多酚、蘋果多酚、葡萄多酚、芒果多酚、石榴多酚等，都表明它們有很強(qiáng)的抗氧化以及預(yù)防各種疾病的能力。研究顯示，植物多酚具有很強(qiáng)的抗氧化作用，以及明顯的抑菌、抗癌、抗老化和抑制膽固醇上升等功效，攝取一定量的植物多酚能夠有效的預(yù)防和抑制疾病的發(fā)生。因此，植物多酚是自由基清除劑因此，在日本有人將植物多酚稱之為繼第六營(yíng)養(yǎng)素膳食纖維之后的“第七類營(yíng)養(yǎng)素”。

野生獼猴桃是中國(guó)特有的植物品種，廣泛分布于中國(guó)東北大興安嶺地區(qū)，對(duì)它們的研究報(bào)道很少，以前的研究顯示了中華獼猴桃的抗氧化活性，從野生獼猴桃中提取多酚等抗氧化成分，對(duì)其成分及其抗氧化功能進(jìn)行分析，可以很好的評(píng)價(jià)其品質(zhì)，揭示野生獼猴桃資源的要要哪個(gè)價(jià)值及抗氧化機(jī)理，為進(jìn)一步開發(fā)功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

狗棗獼猴桃、軟棗獼猴桃采自大興安嶺地區(qū)，中華獼猴桃購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平；榨汁機(jī)，超聲波；離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；紫外分光光度計(jì)，顯微鏡；酶標(biāo)儀；X射線儀。所用的試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃多酚的提取。分別稱取狗棗獼猴桃（Actinidia kolomikta）、軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis）各200g，用60%的乙醇按照1∶5的料液比，40℃，超聲30min提取多酚［3］，重復(fù)提取3次，將3次提取液合并，50℃濃縮，分別濃縮至50mL，分裝后并于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 獼猴桃多酚含量的測(cè)定。獼猴桃多酚含量是使用Folin－Ciocalteu方法經(jīng)過一些修改進(jìn)行測(cè)定。用10mL蒸餾水溶解0.5g沒食子酸，定容至100mL，再將其稀釋50倍，得0.1mg／mL的沒食子酸溶液。從中吸取此濃度沒食子酸0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL比色管中，加入蒸餾水定容到2mL，搖勻后加入1.0mL福林酚試劑，4min后加入1.0mL10%的NaCO3溶液，25℃水浴2h，測(cè)定溶液在765nm處的吸光度，并做3組平行試驗(yàn)［4］。

1.3.3 總還原能力的測(cè)定。采用普魯士藍(lán)法，在10mL試管中加入不同濃度樣品1mL，0.6mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol／L，pH＝6.6），和1.5mL 1%鐵氰化鉀，置于50度恒溫水浴中反應(yīng)20min。流水冷卻至室溫。加入3mL 10%冰乙酸，放置10min，取反應(yīng)液3mL，加入5mL蒸餾水和0.2mL 1%FeCl溶液，混合均勻。5min后于波長(zhǎng)為517nm分光光度計(jì)下測(cè)定其吸光度。吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)，以蒸餾水代替鐵氰化鉀溶液同時(shí)做本底［5］。

1.3.4 細(xì)胞的培養(yǎng)。將復(fù)蘇的 HT－29、HepG2細(xì)胞株置于含10%胎牛血清的1640、DMEM完全培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱、飽和濕度條件下傳代培養(yǎng)。

1.3.5 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)為對(duì)照組、試驗(yàn)組。試驗(yàn)組、對(duì)照組分別以細(xì)胞濃度1×104／mL將兩種癌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后加藥，使藥物的終濃度分別為0、8、16、24、32、40mg／mL；對(duì)照組加入等體積的PBS溶液，每組設(shè)置6個(gè)平行。分別孵育24、48、72h后，每孔加入5mg／mL MTT溶液10μL，37℃孵育4h，棄上清，加入150μL DMSO后振蕩搖勻，置酶標(biāo)儀上測(cè)量波長(zhǎng)490nm，參考波長(zhǎng)655nm測(cè)OD值［6］。按照公式計(jì)算抑制率：

細(xì)胞抑制率（%）＝（對(duì)照組OD值－試驗(yàn)組OD值）／對(duì)照組OD值×100

1.3.6 抗輻射能力測(cè)定。輻射模型的建立：用HepG2作為模型，模擬正常細(xì)胞進(jìn)行輻射研究。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，按照每孔100μL的量將待檢測(cè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞覆蓋率約為孔面積的80%，于37℃，5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)12h。待細(xì)胞全部貼壁，用X射線分別照射30、60、90、120min，輻照后立即放入37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10μL MTT溶液，于37℃孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)溶液，每孔加入150μL DMSO，搖床震蕩15min使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀參考波長(zhǎng)570nm，測(cè)定波長(zhǎng)490nm下測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ)，計(jì)算各組相對(duì)于輻射對(duì)照組的細(xì)胞損傷。結(jié)果顯示照射30min后細(xì)胞的致死率達(dá)到50%左右，選取輻照30min作為輻射模型。

修復(fù)組：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2，Huvel細(xì)胞，制成細(xì)胞懸浮液，按照每孔100μL的量將待檢測(cè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞覆蓋率約為孔面積的80%，于37℃，5%CO2條件下的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)12h。待細(xì)胞全部貼壁，用X射線照射30min，輻照后立即放入37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2h，每組6個(gè)平行孔。向每孔中加入等體積不同終濃度的獼猴桃粗提物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10μL MTT溶液，于37℃孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)溶液，每孔加入150μL DMSO，搖床震蕩15min使結(jié)晶物充分溶解，酶標(biāo)儀參考波長(zhǎng)570nm，測(cè)定波長(zhǎng)490nm下測(cè)定各孔吸光度值A(chǔ)，計(jì)算各組相對(duì)于輻射對(duì)照組的細(xì)胞損傷［7］。

防護(hù)組：是在同樣條件下，待細(xì)胞體壁后加入不同濃度的獼猴桃粗提物，再用X射線照射，之后同于修復(fù)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃多酚含量

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

將狗棗、軟棗、中華獼猴桃提取液稀釋合適的濃度，吸取1mL于10mL比色管中，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法，在765nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，獼猴桃多酚含量分別為：狗棗獼猴桃中多酚含量為430.0313mg／100g鮮果，軟棗獼猴桃中多酚含量為362.1771mg／100g鮮果，中華獼猴桃中多酚含量為115.7609mg／100g鮮果。狗棗獼猴桃＞軟棗獼猴桃＞中華獼猴桃。

2.2 總還原力的測(cè)定

圖2 三種獼猴桃和VC總還原能力的測(cè)定

通過總還原力的測(cè)定，可以檢測(cè)樣品是否為良好的電子供體。還原力強(qiáng)的物質(zhì)可以提供更多的電子，其供應(yīng)的電子除了可以使Fe3＋還原為Fe2＋外，也可以參與自由基反應(yīng)，使自由基形成穩(wěn)定的物質(zhì)。以Vc為對(duì)照，測(cè)定了三種獼猴桃提取物的總還原能力（圖2）?？傔€原力隨獼猴桃粗提物濃度的增加而升高，且在相同的濃度下，狗棗獼猴桃的總還原力最強(qiáng)，其次是軟棗獼猴桃，最后是中華獼猴桃。

2.3 抗癌能力測(cè)定

圖3 加藥24、48、72h對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率

使用MTT方法測(cè)定獼猴桃粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖率的影響，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖可以看出，在不同的時(shí)間內(nèi)軟棗獼猴桃對(duì)HepG2具有很好的抑制作用。其次是軟棗獼猴桃和中華獼猴桃。三種獼猴桃對(duì)HepG2的抑制效果呈明顯的劑量依賴關(guān)系。這與獼猴桃粗提物中的多酚含量相關(guān)。同時(shí)以前的研究報(bào)道獼猴桃中富含硒類化合物，這是已知的抗癌類礦物質(zhì)［8］。軟棗獼猴桃具有比狗棗更高的抗癌活性，我們推測(cè)軟棗獼猴桃比其他兩種獼猴桃中富含更多的硒類化合物。因此，HepG2細(xì)胞更容易受到硒類化合物的攻擊。

2.4 抗輻射能力的測(cè)定

圖4 狗棗、軟棗對(duì)HepG2、Huvel細(xì)胞的修復(fù)作用

圖5 狗棗、軟棗對(duì)HepG2、Huvel細(xì)胞的防護(hù)作用

用HepG2模擬正常細(xì)胞，結(jié)果顯示修復(fù)組和防護(hù)組中，X射線照射后，HepG2和Huvel細(xì)胞存活數(shù)明顯降低，兩組實(shí)驗(yàn)分別加藥24h后狗棗獼猴桃對(duì)HepG2和Huvel細(xì)胞有很好的修復(fù)和防護(hù)作用，而軟棗獼猴桃對(duì)HepG2和Huvel細(xì)胞沒有起到有效的修復(fù)和防護(hù)作用。有實(shí)驗(yàn)報(bào)道酚類化合物具有很好的抗輻射作用。因此，狗棗獼猴桃良好的抗輻射作用與自身含有大量的多酚類化合物有關(guān)。

3 結(jié)論

眾所周知，用于食品中的天然抗氧化劑比人工合成的抗氧化劑更安全、更有益于健康。我們的結(jié)果顯示狗棗和軟棗獼猴桃都有很好的還原能力，粗提物中，狗棗獼猴桃含有最高的多酚含量且具有最好的抗輻射能力。但是軟棗獼猴桃有更好的抗癌能力，這可能是與以前報(bào)道的獼猴桃中富含硒類化合物有關(guān)，軟棗獼猴桃可能含有更多的硒類化合物。它們的這些活性很多都?xì)w因于獼猴桃中存在的植物化學(xué)物質(zhì)的相互作用。獼猴桃粗提物中還很有很多的活性成分，有待于進(jìn)一步的研究開發(fā)，為開發(fā)功能性食品提供理論依據(jù)。

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