樊梓鸞，王振宇，2＊，左麗麗，田雙起

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

大量數(shù)據(jù)表明，許多慢性病都與過(guò)量的自由基產(chǎn)生有關(guān)。自由基通常包括活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）。大多數(shù)活性氧產(chǎn)生于細(xì)胞的線粒體呼吸鏈［1］。內(nèi)源性代謝反應(yīng)過(guò)程中，好氧細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，如超氧陰離子，過(guò)氧化氫（雙氧水），羥自由基（OH·），在缺氧條件下，線粒體呼吸鏈產(chǎn)生一氧化氮（NO），它可以產(chǎn)生活性氮。RNS可以進(jìn)一步反應(yīng)生成其他反應(yīng)基團(tuán)，例如，丙二醛和4－羥基物，將誘導(dǎo)過(guò)多的脂質(zhì)過(guò)氧化。

紅豆越橘（Vaccinium vitis－idaea）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vacciniumspp.）常綠小灌木［2］，俗稱雅格達(dá)，主要分布N52°以北大興安嶺森林中，果實(shí)為亮紅色，是提取天然色素的重要原料，在越橘的果實(shí)和莖葉中含有花色苷、黃酮、萜類等多種活性成分。紅豆越橘中最主要的酚類化合物是花色苷，是一種強(qiáng)抗氧化劑，能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化和生物系統(tǒng)的氧化；可以預(yù)防和減少炎癥、癌細(xì)胞增殖的危險(xiǎn)［3］。飲食富含花色苷的果汁對(duì)冠狀心臟病人有益，體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，花色苷可以有效的改善記憶力［4］。本文采用X－5大孔樹(shù)脂純化富集花色苷，并對(duì)分離得到的組分進(jìn)行活性跟蹤，分析抗氧化和抗癌細(xì)胞增值活性。為開(kāi)發(fā)高純度花色苷類物質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

紅豆越桔樣品于2010年采自大興安嶺加格達(dá)奇，－20℃凍存。癌細(xì)胞株：結(jié)腸癌HT29、卵巢癌Hela、肺癌A549和肝癌HepG－2細(xì)胞，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤分院提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BS110型電子天平；721型分光光度計(jì)，JJ－2型組織粉碎機(jī)，F(xiàn)A25高剪切分散乳化機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅豆越橘提取物制備。用天平稱取凍存漿果20kg，加入冷凍的80%丙酮（1∶2w／v）在組織搗碎機(jī)中勻漿5min，從搗碎機(jī)中取出勻漿，在高速均質(zhì)機(jī)中均質(zhì)3min，放入抽濾瓶上的布式漏斗中，漏斗上放置濾紙，抽濾瓶接真空泵進(jìn)行抽濾。收集濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，在45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏，于－80℃儲(chǔ)存，用于后續(xù)純化富集用。

1.3.2 大孔樹(shù)脂富集純化紅豆越橘花色苷

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選定大孔吸附樹(shù)脂X－5富集純化花色苷，首先進(jìn)行樹(shù)脂預(yù)處理，裝柱上樣，靜態(tài)吸附，用蒸餾水沖洗柱層析，除去糖分及小分子物質(zhì)，用斐林試劑（斐林試 劑 甲：0.1g／mL NaOH，斐 林 試 劑 乙：0.05g／mL CuSO4）檢測(cè)殘?zhí)橇?，大約兩個(gè)柱體積后既無(wú)殘?zhí)恰２捎?0%～60%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2mL／min，每250mL收集一餾分，分別測(cè)定多酚含量和抗氧化活性。

1.3.3 樣品中多酚含量測(cè)定

采用菲林酚比色法檢測(cè)多酚含量［5］。精密吸取125μL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或漿果提取物，分別置于l0mL試管中，加入0.5mL的蒸餾水，再加入125μL的菲林酚試劑（FCR），樣品混合充分，靜置6min，加入1.25mL 7%Na2CO3水溶液。用水補(bǔ)足終體積到3mL。90min后在760nm測(cè)定藍(lán)色溶液的吸光度。沒(méi)食子酸作標(biāo)品，結(jié)果用平均值表示［mg沒(méi)食子酸等同量／l00g鮮重（fresh weight FW）］，±SD三個(gè)重復(fù)。

1.3.4 ABTS法測(cè)定抗氧化能力

配制ABTS自由基工作液。將樣品用甲醇配制成一系列濃度，取0.1mL不同濃度的稀釋提取液加入1.5mL ABTS自由基工作液，混合，放置6min后，在734nm處測(cè)定吸光度［6］。每份樣品平行操作3次，計(jì)算公式為：

清除率（%）＝［（AContral－ASample）／AContral］×100%

式中：AContral為1.5mL ABTS溶液與0.1mL甲醇混合后的吸光度，ASample為1.5mL ABTS溶液與0.1mL樣品混合后的吸光度。

1.3.5 抗細(xì)胞增值活性

所有細(xì)胞培養(yǎng)基添加10%胎牛血清，50單位／mL青霉素，50μg／mL鏈霉素，100μg／mL慶大霉素。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的癌細(xì)胞，使其濃度在1×104～5×104細(xì)胞／每孔，在96孔板上鋪板，37℃培養(yǎng)12h后，加入不同濃度的提取物，三次重復(fù)。無(wú)提取物的培養(yǎng)基作為空白，處理48h，72h后，加入 MTT，4h后，棄去上清液，加入150μL DMSO，在490nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞的增殖活性［7］。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用Sigmaplot 10.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹(shù)脂X－5富集有效組分的確定

對(duì)紅豆越桔粗提物進(jìn)行富集，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選取X－5大孔吸附樹(shù)脂，采用10%～60%乙醇梯度洗脫，洗脫流速2mL／min，每250mL收集一組餾分，共收集了12個(gè)組分，結(jié)果如圖1所示，組分2、3、4、5具有較高的多酚含量和抗氧化活性，因此將此四種組分分別命名為L(zhǎng)B－2、LB－3、LB－4、LB－5，并將其混合組分命名為L(zhǎng)B－MIX。

圖1 大孔吸附樹(shù)脂X－5富集分離紅豆越橘丙酮提取物，10%～60%乙醇梯度洗脫共收集12個(gè)組分

2.2 抗結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖活性

將大孔樹(shù)脂純化的后的5組樣品及陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺，分別作用結(jié)腸癌HT29細(xì)胞48h和72h后，如圖2所示，處理48h后，環(huán)磷酰胺和LB－4各劑量組對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制活性沒(méi)有 LB－MIX、LB－2、LB－3和 LB－5效果明顯。其中LB－MIX在48h后對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制活性最強(qiáng)，但作用72h后，LB－5對(duì)癌細(xì)胞的抑制活性最大，細(xì)胞只增殖了22.25±5.45%。

圖2 紅豆越橘初級(jí)純化產(chǎn)物在48h和72h抑制結(jié)腸癌HT29細(xì)胞增殖活性

2.3 抗肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性

如圖3所示，各組分抑制肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的增殖活性呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，劑量的增大表現(xiàn)出明顯的抑制肝癌細(xì)胞活性。48h，LB－MIX對(duì)癌細(xì)胞的抑制增殖活性達(dá)到22.25±5.45%。72h，對(duì)癌細(xì)胞的抑制增殖活性達(dá)到13.64±0.88%。其次為 LB－5、LB－3。LB－2、LB－4和環(huán)磷酰胺對(duì)癌細(xì)胞抑制增殖活性沒(méi)有達(dá)到半數(shù)抑制率。

圖3 紅豆越橘初級(jí)純化產(chǎn)物在48h和72h抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性

2.4 抗卵巢癌Hela細(xì)胞增殖活性

如圖4所示，LB－MIX、LB－5、LB－3能夠明顯的抑制卵巢癌Hela細(xì)胞的增殖并隨著濃度的增加抑制活性增強(qiáng)，48h，72h后，LB－MIX濃度達(dá)到400μg／mL時(shí)，其對(duì)癌細(xì)胞的抑制增殖活性分別達(dá)到29.04±3.32%和24.27±3.05%。其次，為L(zhǎng)B－5和LB－3。

圖4 紅豆越橘初級(jí)純化產(chǎn)物在48h和72h抑制卵巢癌Hela細(xì)胞增殖活性

2.5 抗肺癌A549細(xì)胞增殖活性

圖5 紅豆越橘初級(jí)純化產(chǎn)物在48h和72h抑制肺癌A549細(xì)胞增殖活性

如圖5所示，抗癌活性由大到小依次為L(zhǎng)B－MIX＞ LB－5＞LB－3＞ LB－2＞ LB－4＞ 環(huán)磷酰胺。72h后，LB－MIX抑制A549增殖最有效，其只增殖了12.67±0.37%。

3 結(jié)論

紅豆越橘粗提物經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂X－5純化后，分部收集最有效地組分，進(jìn)行抗氧化和抗癌細(xì)胞增殖活性分析，結(jié)果顯示，紅豆越橘的總純化組分的抗癌活性比分部收集的組分還要好，因此選定總純化組分作為后續(xù)的研究對(duì)象。

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