畢海林，楊正松,2，楊洪濤，黃杏娥，和志嬌，木永青，和加衛(wèi)*

(1.云南省農業(yè)科學院 高山經濟植物研究所，云南 麗江 674199;2.麗江藍瑪生物科技開發(fā)有限責任公司，云南 麗江 674199)

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)的一種常綠灌木。越橘屬約有450種，分布北半球溫帶、亞熱帶，美洲和亞洲的熱帶山區(qū)。我國已知91種、24變種、2亞種，主產分布在西南和華南地區(qū)，云南省已知的越橘屬植物有45種、12變種[1]。白果越橘通常附生，高0.5～1.0 m，果實球形或略扁，綠色至雪白色，果梗紅色，棒狀，花期3～4月，果期5～8月，分布于中國云南(貢山、碧江、滬水)、西藏(墨脫)，也分布于不丹、印度(阿薩姆)和緬甸(東北部)，生長于海拔2100～2800 m的常綠闊葉林中，附生樹上或巖石上[2]。越橘屬果實基本為藍果類型，極少數為紅果類型，如紅豆越橘(Vacciniumvitis-idaea)、蔓越橘(Oxycoccos)、紅果越橘(VacciniumhirtumThunb.)和紅莓苔子(VacciniumoxycoccosLinn.)等，目前培育成的紅果類型越橘栽培品種為紅粉佳人。越橘屬白果類型僅為白果越橘，其果實雪白色，晶瑩剔透，果實不但營養(yǎng)價值高，而且十分漂亮，具有較高的觀賞價值。白果越橘果實極具特色，因此可在越橘育種工作中發(fā)揮極重要的應用價值。

目前，國內外對白果越橘的研究僅限于野生資源分布及其生物學性狀等，白果越橘資源收集及評價、引種馴化、嫁接、根瘤及其菌根真菌、種苗繁育技術等方面的研究還需要進一步加強，以此對我國的白果越橘種質資源進行合理開發(fā)利用。研究白果越橘種苗快速繁育技術，對保存我國的越橘種質資源和合理開發(fā)利用將發(fā)揮重要作用。近年來，越橘栽培品種組織培養(yǎng)育苗技術在我國已經比較成熟。劉慶忠[3]、李麗容[4]、張長青[5]、朱忠榮[6]、余強波[7]、劉捷[8]等對兔眼藍莓和高叢藍莓進行了組織培養(yǎng)技術研究。和加衛(wèi)等[9]對野生越橘云南越橘進行了組織培養(yǎng)研究，而白果越橘的組培快繁技術尚未見報道。本文對白果越橘進行了組織培養(yǎng)技術研究，摸索出了白果越橘組織培養(yǎng)快速繁殖技術，為下一步白果越橘資源的開發(fā)利用奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

白果越橘(VacciniumleucobotrysNutt.)的果實、種子及植株枝條取自云南省麗江高山植物園資源圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒及初代培養(yǎng) 以白果越橘成熟果實內帶果肉的新鮮種子、干種子、嫩枝條莖段作為外植體。8月中旬取白果越橘成熟果實和枝條進行處理，干種子為成熟果實中洗出并晾干的當年種子。外植體消毒和接種:以成熟果實為消毒材料，將帶果肉的種子作為外植體；以用水浸泡2 d的種子為外植體；以帶1～2個腋芽的嫩莖段為外植體；將果實、種子、莖段均用洗衣粉液浸泡5 min，流水沖洗2 h，然后放入超凈臺，70%乙醇消毒30 s，再用0.1%升汞溶液分別消毒15、6和10 min，無菌水浸洗5次后供接種使用；將消毒后的果實去除果皮，將內部帶著果肉的種子和莖段直接接種在以下4種培養(yǎng)基上。4種誘導培養(yǎng)基分別為:MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA、MS+1.0 mg/L ZT、WPM+1.0 mg/L ZT，培養(yǎng)溫度為25 ℃,光照強度為2000 lx,光照時間為12 h/d，培養(yǎng)基pH為5.4。1個果實接種5瓶培養(yǎng)基，1瓶培養(yǎng)基接種1粒種子，1瓶培養(yǎng)基接種1個莖段，以12個果實、60粒種子、60個莖段為1個組合，分別重復3次，60 d以后進行統計及分析。

1.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 培養(yǎng)基均為WPM培養(yǎng)基。將初代培養(yǎng)萌發(fā)的種子苗和腋芽剪成1 cm的莖段，接種到含不同激素的8種增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)基見表2,培養(yǎng)基pH為5.4。每瓶接10個莖段，3瓶作為一個觀察組合，60 d后觀察苗的生長情況及統計增殖系數；將培養(yǎng)基pH值分別設定為4.2、4.6、5.0、5.4、5.8，培養(yǎng)基中激素均為ZT，濃度為0.5 mg/L，每種pH值接種3瓶，每瓶接10個莖段，每個莖段長1 cm左右，60 d后測量苗的長度及統計增殖系數。

1.2.3 生根培養(yǎng)及試管外扦插 將試管苗剪去基部愈傷組織，蘸1000 mg/L NAA后分別扦插在松針粉、苔蘚、草炭土和細腐殖土4種基質中，基質分別盛放在70孔穴盤中，每種基質觀察3個穴盤，扦插以后放入大棚內，觀察生根情況。

2 結果與分析

2.1 不同白果越橘外植體初代培養(yǎng)生長情況

由表1可以看出，白果越橘成熟果實中帶果肉的種子、干種子和植株嫩莖段用0.1%升汞溶液分別消毒15、6、10 min后，污染率均較低。成熟果實中帶果肉的種子在培養(yǎng)基上2～3 d就開始膨大，5 d就開始萌發(fā)，萌發(fā)很快，且萌發(fā)率很高，除極細小的不飽滿種子外基本都能萌發(fā)；而浸泡的干種子萌發(fā)較慢，萌發(fā)率也較低，有些種子一直不萌發(fā)，種皮變褐，說明消毒劑對種子造成了傷害，而且干種子經過儲藏后活力也有所降低；莖段在不同種類培養(yǎng)基上腋芽的萌發(fā)時間差別較大，WPM培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)較快，MS培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)較慢，而2種培養(yǎng)基上腋芽萌發(fā)率倒是差異不大。成熟果實中帶果肉的種子、干種子和莖段在4種培養(yǎng)基上苗的生長速度差異相當明顯，WPM培養(yǎng)基上苗生長較快，MS培養(yǎng)基上苗生長較慢，加有玉米素ZT的培養(yǎng)基中苗的生長速度明顯比加有6-BA和NAA的培養(yǎng)基快得多。由此說明，加有玉米素ZT的WPM培養(yǎng)基有利于白果越橘種子實生苗及莖段腋芽的生長。

另外，白果越橘種子萌發(fā)后，在莖的基部有橢圓形淡綠色的組織形成，在實生苗生長發(fā)育過程中逐漸變成淡黃紅色，并在相當長一段時期內仍然存在，這種橢圓形組織在發(fā)育過程中的變化有待進一步觀察。該橢圓形組織可能是白果越橘的根瘤，需要進一步進行成分分析及鑒定。

2.2 白果越橘在不同條件下繼代增殖培養(yǎng)

2.2.1 不同激素配比對白果越橘增殖的影響 由表2可以看出，培養(yǎng)60 d后，不同濃度的6-BA和NAA對白果越橘的增殖影響均不明顯，白果越橘試管苗生長緩慢，長高較少，有黃綠色愈傷組織形成，但愈傷組織不分化形成叢生芽，說明6-BA和NAA對白果越橘的增殖效果不顯著。而加有玉米素ZT的培養(yǎng)基中，苗生長較好，增殖系數均較高，ZT濃度較低時，試管苗較高，基本上都是單苗，極少形成叢生苗，隨著ZT濃度增高，有較多的苗形成叢生苗，并且隨著培養(yǎng)代數的增加，試管苗逐漸細弱。綜合來看，WPM+0.5 mg/L ZT更有利于白果越橘的長期增殖及生根培養(yǎng)。

表1 3種白果越橘外植體初代培養(yǎng)生長情況

表2 白果越橘在不同激素配比條件下的增殖情況

2.2.2 不同pH值對白果越橘增殖的影響 由表3可以看出，不同pH值對白果越橘增殖影響極大。在試驗過程中，pH值為4.2時，每升培養(yǎng)基需要加入大量瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，且培養(yǎng)基顏色不透亮，幾乎沒有彈性，增殖60 d后，苗幾乎沒有長高，苗幾乎沒有什么變化。pH值為4.6時，每升培養(yǎng)基也需要加入大量瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，培養(yǎng)基顏色不透亮，幾乎沒有彈性，增殖60 d后，苗長高較少。pH值為5.0時，每升培養(yǎng)基需要加入較多瓊脂粉培養(yǎng)基才能凝固，且培養(yǎng)基顏色較透亮，稍有彈性，增殖60 d后，苗長高較多，部分苗基部形成2個叢生芽。當pH值為5.4時，每升培養(yǎng)基加入較少瓊脂粉培養(yǎng)基就能凝固，且培養(yǎng)基顏色透亮，很有彈性，增殖60 d后，苗長高最多，部分苗基部形成2～3個叢生芽，增殖系數最高。pH值為5.8時，每升培養(yǎng)基加入少量瓊脂粉培養(yǎng)基就能凝固，且培養(yǎng)基顏色很透亮，有彈性，增殖60 d后，苗長高較多，部分苗基部也形成2個叢生芽。綜上所述，較高的pH值有利于白果越橘的增殖，培養(yǎng)基pH值為5.4時，試管苗增殖系數最高，白果越橘的增殖效果最好。

2.3 不同基質對白果越橘試管苗瓶外扦插生根的影響

藍莓組培苗在試管內生根效果不佳，生根慢，生根率僅為30%～70%，因此主要采用試管外生根方法[10]。因此，本試驗沒有對白果越橘進行試管內生根培養(yǎng)，而是直接進行試管外扦插生根試驗。

表3 白果越橘在不同pH值培養(yǎng)基中的增殖情況

由表4可以看出，白果越橘試管苗扦插在4種基質中的生根情況均較好。苔蘚和草炭土13 d左右后多數枝段基部均形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數目不一的無色短根，一段時間后根變白，再變黃，60 d后統計觀察發(fā)現，絕大多數枝段均長根，生根率達到95%左右，且根基本長滿整孔基質，草炭土中的苗長高較多，苔蘚中的苗長高較少；細腐殖土為基質的穴盤中，15 d后多數枝段基部也形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數目不一的無色短根，一段時間后根變白，再變黃，60 d后統計觀察發(fā)現，絕大多數枝段均長根，生根率達到91%左右，根基本長滿整孔基質，苗長高很多；松針粉為基質的穴盤中，約16 d后多數枝段基部也形成少量愈傷組織，愈傷組織及其稍上方冒出數目不一的無色短根，一段時間后根變白，再變黃，60 d后統計觀察發(fā)現，絕大多數枝段均長根，生根率稍低，為87%左右，苗長高也較少。由此可見，苔蘚、草炭土和細腐殖土均可作為白果越橘試管苗瓶外生根的基質。

表4 白果越橘試管苗在4種基質中的生根情況

3 討論與結論

越橘屬白果類型僅為白果越橘，果實極具特色，具有較高的觀賞價值，在越橘育種工作中具有極重要的應用價值。研究白果越橘組織培養(yǎng)快速繁殖技術，對保存我國的越橘種質資源和合理開發(fā)利用將發(fā)揮重要作用。

組織培養(yǎng)育苗方法已在藍莓生產上獲得成功并成為我國目前藍莓育苗的一種主要方式。應用組培方法繁殖速度快，結合日光溫室等可以不受季節(jié)限制，并有利于苗木的生長，適宜于優(yōu)良品種的快速擴繁。藍莓組培苗在試管內生根效果不佳，生根慢，生根率僅為30%～70%，因此主要采用試管外生根方法[10]。目前，藍莓生根扦插基質主要為苔蘚和草炭土，一般在扦插13 d后就開始生根，生根效果好，生根率高。

本試驗嘗試用2種新的扦插基質，即松針粉和細腐殖土，生根效果也較好。其中細腐殖土生根率較高，而且苗長根以后，苗生長明顯較快，主要是因為腐殖土養(yǎng)分較足，有利于促進苗的生長，因此，腐殖土是一種很好的白果越橘扦插基質。松針也是粉碎后才能作為扦插基質，本試驗中以其為扦插基質，苗的生根率較低，苗長根以后生長也較緩慢，但松針的成本較低。以草炭土作為生根基質，苗長根以后生長也較快，但根部土團容易散開，不方便運輸，只宜就近上缽管理。而以苔蘚、松針粉、細腐殖土為基質，根長好以后，根在這3種基質中很好地纏繞形成不易散開的團塊，方便長途運輸。因此，各地應根據自身實際，來選擇白果越橘試管外生根扦插基質。

試驗表明，白果越橘成熟果實中的新鮮種子和嫩莖段是白果越橘組織培養(yǎng)適宜的外植體。激素對于植物組織和器官的形成具有重要作用，植物的每個生理生化過程都直接或間接地受到生長調節(jié)物質的調控。[11]本試驗表明，幾種激素中，玉米素對白果越橘種子實生苗及嫩莖段腋芽萌發(fā)、生長以及增殖效果最好。WPM+1.0 mg/L ZT最有利于白果越橘種子實生苗及嫩莖段腋芽萌發(fā)及生長。WPM+0.5 mg/L ZT有利于白果越橘的大量增殖。培養(yǎng)基pH值對其增殖有很大影響，pH值為5.4最有利于白果越橘的增殖，試管苗增殖系數最高。細腐殖土是一種較理想的扦插基質，可以替代苔蘚和草炭土作為白果越橘試管苗的扦插基質。

另外，白果越橘種子萌發(fā)后，在莖的基部有橢圓形淡綠色的組織形成，這種橢圓形組織在苗的發(fā)育過程中隨著實生苗的長大而逐漸變大。該橢圓形組織可能是白果越橘的根瘤，需要進一步進行成分分析及鑒定。如果確實是根瘤的話，根瘤的形成是菌根真菌侵染的結果，那就說明白果越橘實生苗中有菌根真菌的存在，這將是一項具有重要意義的研究?，F已確認侵染越橘的菌根真菌類型為內生菌根真菌,這一類菌根真菌專性寄生杜鵑花科植物,因而統稱為杜鵑花菌根真菌(Ericoidmycorrhiza)[12-16]。在自然條件下，越橘都與菌根真菌共生。本研究主要是對白果越橘進行了組織培養(yǎng)技術研究，白果越橘的根瘤以及菌根真菌以及其他開發(fā)利用還有待于今后更加深入的研究。

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