李小玲，華智銳，祝 穎，賀廣祥

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000)

高山杜鵑(Rhododendrondelavayi)是杜鵑花科杜鵑花屬植物的總稱。它既是世界三大高山花卉之一，也是中國(guó)十大名花之一[1]。高山杜鵑原種的70%早在100多年前從中國(guó)引入歐洲，歐洲人經(jīng)過上百年的研究，培育出了中國(guó)杜鵑品種與歐美杜鵑品種的雜交種[2]。高山杜鵑耐寒，喜陰涼和濕潤(rùn)的環(huán)境，多生長(zhǎng)在海拔1000 m以上的高山、草甸、林緣地區(qū)[3]。陜西秦嶺野生杜鵑花屬植物以其豐富的種類、鮮艷多姿的花型、四季常青的特點(diǎn)博得了人們的喜愛，它不僅具有一定的觀賞價(jià)值，而且其枝葉可以用來入藥，因此具有較高的開發(fā)利用價(jià)值[4]。鎮(zhèn)安木王國(guó)家森林公園，地處陜西省商洛市鎮(zhèn)安縣楊泗鄉(xiāng)，享有“千山杜鵑”、“杜鵑故里”的美譽(yù)。該地區(qū)杜鵑花種類主要包括秀雅杜鵑、美容杜鵑、頭花杜鵑、照山白等，其中分布數(shù)量最大，面積最廣的為美容杜鵑[5]。

溫度是植物正常生理代謝的主要生態(tài)因子之一，極端溫度不僅會(huì)影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育、引起植物代謝紊亂，而且嚴(yán)重時(shí)還會(huì)造成植株的死亡。低溫是植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中經(jīng)常遭受的非生物脅迫因子之一[6]，低溫可作為環(huán)境信號(hào)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起植物體內(nèi)酶活性的改變及基因表達(dá)，進(jìn)而影響植物重要的生理生化反應(yīng)[7-8]。

本研究以秦嶺高山杜鵑幼苗為材料，通過探討低溫脅迫對(duì)高山杜鵑丙二醛(MDA)含量、相對(duì)電導(dǎo)率、游離脯氨酸含量、可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性的影響，從理論上揭示高山杜鵑對(duì)低溫脅迫的生理生態(tài)適應(yīng)機(jī)制，為高山杜鵑休眠狀態(tài)的解除和抗寒性品種的選育提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用高山杜鵑幼苗于2017年4月上旬采自商洛市鎮(zhèn)安縣木王國(guó)家森林公園海拔1500 m左右的茨溝杜鵑花景區(qū)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料預(yù)培養(yǎng) 將采集的株高10 cm的高山杜鵑幼苗移栽到直徑為15 cm的花盆中，每盆種植1株，盆栽基質(zhì)為腐葉土∶松針土=1∶2。培養(yǎng)期間于每天傍晚噴灑0.1%～0.5%的硫酸亞鐵水溶液以保持盆土濕潤(rùn)。低溫脅迫前將所栽的高山杜鵑幼苗先放入常溫下連續(xù)培養(yǎng)10 d，然后選取生長(zhǎng)一致的幼苗用于試驗(yàn)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)分別設(shè)置0、5、10、25 ℃這4個(gè)溫度梯度處理高山杜鵑幼苗，其中以25 ℃作為對(duì)照溫度。然后將試驗(yàn)材料分別放入設(shè)有不同溫度的人工氣候箱內(nèi)，相對(duì)濕度為72%，每天光照處理12 h，光照強(qiáng)度約為1000 lx，黑暗處理12 h，連續(xù)培養(yǎng)6 d。經(jīng)過低溫脅迫后，分別采第1天、第2天、第3天、第4天、第5天的高山杜鵑葉片并進(jìn)行處理，每個(gè)處理溫度稱取1.5～3.0 g除去主脈、健康生長(zhǎng)無病害的葉片，分別測(cè)定高山杜鵑相關(guān)的生理指標(biāo)，每次試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率測(cè)定參照陳建勛等[9]的電導(dǎo)儀法；游離脯氨酸含量測(cè)定參照許維岸[10]的茚三酮法；MDA含量的測(cè)定參照張志安等[11]的硫代巴比妥酸法；SOD活性的測(cè)定參照李合生[12]的氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法；POD活性的測(cè)定參照郝再彬等[13]的愈創(chuàng)木酚顯色法；CAT活性的測(cè)定參照高俊鳳[14]的紫外光譜法；可溶性蛋白含量的測(cè)定參照高俊鳳[14]的考馬斯亮藍(lán)G-250法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有處理每次測(cè)定重復(fù)3次，取3次測(cè)定值的平均值，用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，與對(duì)照溫度相比，其它溫度處理下相對(duì)電導(dǎo)率均明顯高于對(duì)照組，且溫度越低增加幅度越大。而不同溫度處理下，除對(duì)照組溫度條件下電導(dǎo)率相對(duì)平穩(wěn)外，隨著時(shí)間延長(zhǎng)相對(duì)電導(dǎo)率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，到處理第5天時(shí)，0、5、10 ℃下電導(dǎo)率與對(duì)照組25 ℃時(shí)相比，增加幅度分別達(dá)到90.11%、49.79%和27.07%，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

圖1 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.2 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑MDA含量的影響

由圖2可知，高山杜鵑幼苗的MDA含量在相同溫度下隨著時(shí)間的增加而增加。而在同一時(shí)間的不同溫度下，溫度越低，MDA含量越高。0 ℃時(shí)MDA含量的變化最大，上升最快。與對(duì)照溫度處理下的MDA含量相比，10 ℃處理下的MDA含量變化不顯著(P>0.05)；5 ℃處理下的MDA含量則顯著增加(P<0.05)，比對(duì)照增長(zhǎng)了68.32%；而0 ℃處理下的MDA含量差異最為顯著(P<0.05)，與對(duì)照相比增加幅度為88.12%。

圖2 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑MDA含量的影響

2.3 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑SOD、POD和CAT活性的影響

由圖3可以看出，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD的活性呈先升后降再上升的趨勢(shì)，總體上呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。在相同時(shí)間內(nèi)，隨著溫度的降低，高山杜鵑幼苗葉片的SOD活性上升，第5天時(shí)0、5、10 ℃處理下杜鵑幼苗葉片的SOD活性顯著高于室溫處理下的SOD活性(P<0.05)，與對(duì)照相比增加幅度分別為84.87%、54.38%和35.35%。由圖4可以看出，POD活性總體呈上升趨勢(shì)。對(duì)照溫度下POD活性在第1天最高，0 ℃最低。而在第2天時(shí)，0 ℃時(shí)的POD活性增長(zhǎng)最快，比第1天增長(zhǎng)了43.21%，達(dá)到同一天不同溫度處理下POD活性的最高值?？傮w上，在試驗(yàn)期間0 ℃時(shí)POD活性增長(zhǎng)最快，比第一天增長(zhǎng)了86.73%，差異顯著(P<0.05)；5 ℃和10 ℃下POD活性的增長(zhǎng)趨勢(shì)較為接近，對(duì)照溫度下POD活性總體趨于穩(wěn)定。由圖5可以看出，隨著溫度的降低，CAT的活性增加，對(duì)照溫度CAT活性變化比較穩(wěn)定，在10 ℃時(shí)CAT活性的增加量較少，從第2天開始總體趨于穩(wěn)定。0 ℃和5 ℃下CAT活性的變化趨勢(shì)比較明顯，增長(zhǎng)較快，在第5天時(shí)比第1天時(shí)分別增長(zhǎng)了78.45%和86.23%。

圖3 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑SOD活性的影響

圖4 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑POD活性的影響

2.4 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，在低溫脅迫下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高山杜鵑幼苗的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。就同一天來說，隨著溫度的降低，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，其中，低溫0 ℃處理下效果最為顯著(P<0.05)，比對(duì)照增長(zhǎng)了89.43%，在第2天至第3天上升最快，第3天時(shí)相對(duì)于對(duì)照組升高幅度最大，達(dá)86.51%。在10 ℃以下時(shí)，可溶性蛋白含量顯著上升(P<0.05)，5 ℃和0 ℃分別比對(duì)照增長(zhǎng)了84.40%和89.43%。在對(duì)照溫度下可溶性蛋白含量趨于穩(wěn)定。

圖5 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑CAT活性的影響

圖6 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑可溶性蛋白含量的影響

2.5 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑游離脯氨酸含量的影響

由圖7可知，低溫脅迫下，游離脯氨酸含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但各溫度下存在一定的差異。隨著脅迫溫度的降低，高山杜鵑幼苗游離脯氨酸含量增加，但增加量不顯著。在相同溫度下，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，游離脯氨酸含量緩慢增加，變化不明顯。低溫脅迫起始時(shí)，各低溫處理與對(duì)照組的游離脯氨酸含量水平較低，5 d后0、5、10 ℃處理組的游離脯氨酸含量分別上升至190.1、170.8、153.4 μg/g，與對(duì)照相比增加幅度分別為50.51%、35.23%和21.46%，其中0 ℃效果最明顯，與對(duì)照組差異最顯著(P<0.05)。

圖7 低溫脅迫對(duì)高山杜鵑游離脯氨酸含量的影響

3 討論

低溫作為植物生長(zhǎng)發(fā)育的非生物脅迫因子之一，嚴(yán)重影響著植物體內(nèi)的一系列生理生化過程，而植物則通過產(chǎn)生相應(yīng)的抗逆性和耐逆性來適應(yīng)外界環(huán)境的變化[15]。眾多植物抗寒研究報(bào)道指出，在低溫脅迫下，植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量、保護(hù)酶活性等變化與植物抗寒性密切相關(guān)[16-18]。

細(xì)胞質(zhì)膜是細(xì)胞最外面的一層界膜，對(duì)植物起到一定的保護(hù)作用，可以防止外界不良環(huán)境對(duì)植物組織結(jié)構(gòu)的損傷。在低溫脅迫下，植物細(xì)胞膜的選擇透性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)液外滲，進(jìn)而導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率增大，且相對(duì)電導(dǎo)率值的大小與低溫脅迫程度呈正相關(guān)，與植物抗寒能力的強(qiáng)弱呈負(fù)相關(guān)[19]，本試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)論。高山杜鵑在對(duì)照溫度(25 ℃)時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率變化較為穩(wěn)定，隨著溫度的降低，相對(duì)電導(dǎo)率變化程度增大。本試驗(yàn)中，在0 ℃時(shí)高山杜鵑相對(duì)電導(dǎo)率增長(zhǎng)速度最快，同時(shí)也達(dá)到了最大值，原因是0 ℃低溫造成了高山杜鵑幼苗細(xì)胞膜和原生質(zhì)體的損傷，而且其損傷程度會(huì)隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，進(jìn)而造成高山杜鵑膜結(jié)構(gòu)的破壞及膜功能的喪失。

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一。植物體內(nèi)MDA含量的大小可作為判斷膜系統(tǒng)損傷程度和植物抗逆性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)[20]。本試驗(yàn)中，隨著低溫脅迫溫度的降低，高山杜鵑體內(nèi)MDA含量呈上升趨勢(shì)，在0 ℃時(shí)MDA含量增加幅度最大；在相同處理溫度下隨著時(shí)間的延長(zhǎng)MDA含量升高，在第5天時(shí)高山杜鵑MDA含量達(dá)到最大值，與前人的研究結(jié)果[21]一致。MDA的含量在低溫處理前兩天增長(zhǎng)比較緩慢，與對(duì)照相差不大，但是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加深，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)和膜脂功能的損傷加劇，高山杜鵑體內(nèi)MDA含量快速增長(zhǎng)。

低溫脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)積累過多的超氧自由基，從而造成植物體內(nèi)膜脂過氧化作用增強(qiáng)、生物膜透性增加等傷害。植物體內(nèi)的天然超氧自由基清除劑，主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)，它們可以清除逆境下植物體內(nèi)積累的自由基，從而維持自由基的動(dòng)態(tài)平衡[22]?？傮w來說，高山杜鵑體內(nèi)SOD活性表現(xiàn)為先上升后降低再上升的趨勢(shì)，低溫脅迫初期，高山杜鵑體內(nèi)SOD活性顯著升高，隨著脅迫程度的加強(qiáng)，SOD活性開始逐漸下降，而在第4、5天時(shí)SOD活性又繼續(xù)上升。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，SOD活性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在第5天時(shí)達(dá)到最大值。SOD活性隨著溫度的降低而升高，在0 ℃時(shí)增加幅度最大。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)能夠提高植物對(duì)低溫環(huán)境的抗逆性，是因?yàn)镻OD和CAT能夠催化過氧化物分解，降低對(duì)細(xì)胞膜的傷害作用。隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高山杜鵑體內(nèi)POD和CAT的活性總體上呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。溫度越低，POD和CAT活性越高，在0 ℃處理下，雖然高山杜鵑體內(nèi)SOD、POD和CAT活性都有了較為明顯的提高，但MDA含量的急劇上升仍會(huì)對(duì)高山杜鵑的正常生理代謝活動(dòng)產(chǎn)生不良影響。而在5 ℃和10 ℃處理下，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高山杜鵑體內(nèi)MDA含量上升幅度較小，因此對(duì)植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的傷害也較小。

可溶性蛋白在植物體內(nèi)起著維持滲透調(diào)節(jié)及防止原生質(zhì)體脫水的作用。在不同低溫脅迫條件下，植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的高低與植物的抗逆性強(qiáng)弱呈正比[23]。本試驗(yàn)中，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)高山杜鵑體內(nèi)可溶性蛋白含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，10 ℃時(shí)可溶性蛋白含量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)增幅較小，0 ℃和5 ℃增幅較大，與熊燕等[23]的研究結(jié)果一致。

游離脯氨酸是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。低溫脅迫導(dǎo)致了植物原生質(zhì)體脫水從而引發(fā)游離脯氨酸的累積，游離脯氨酸含量的升高可降低冰點(diǎn)，有效防止細(xì)胞脫水，穩(wěn)定原生質(zhì)體及組織內(nèi)的代謝過程，從而保護(hù)植物細(xì)胞免受低溫的傷害[24]。本試驗(yàn)中，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，高山杜鵑體內(nèi)游離脯氨酸含量逐漸升高；隨著脅迫溫度的降低，高山杜鵑體內(nèi)游離脯氨酸含量升高，在0 ℃時(shí)達(dá)到最大值，但是總體變化不大。

綜上所述，秦嶺高山杜鵑幼苗在不同低溫脅迫條件下體內(nèi)各項(xiàng)重要生理指標(biāo)的變化結(jié)果表明，在5 ℃和10 ℃條件下其生長(zhǎng)受到了不同程度的抑制，但仍具有一定抗性；0 ℃低溫條件下生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，不利于植株正常生長(zhǎng)發(fā)育；在25 ℃下生長(zhǎng)較好，但具體適于高山杜鵑生長(zhǎng)的溫度還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 李璟琦,蘇真,張曉靜.秦嶺杜鵑花屬植物資源及其利用研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012,28(22):303-307.

[2] 鮮小林,陳睿.溫度與光強(qiáng)對(duì)高山杜鵑催花期間花芽營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)積累的影響[J].西北植物學(xué)報(bào),2015,35(5):991-997.

[3] 汪源,鞠波.中國(guó)野生杜鵑資源開發(fā)利用探討[J].生物學(xué)雜志,2006,23(1):43-44.

[4] 江福英,李延,翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2002,17(3):190-195.

[5] 趙冰,杜宇科,付玉梅,等.鎮(zhèn)安木王國(guó)家森林公園野生杜鵑花資源調(diào)查[J]. Journal of Landscape Research, 2010, 2(1): 54-56,61.

[6] 李淑順,李倩中,唐玲,等.低溫對(duì)高山杜鵑內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)動(dòng)態(tài)變化及休眠解除的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,27(4):853-857.

[7] 華智銳,李小玲.鹽旱交叉脅迫對(duì)小麥種子萌發(fā)及幼苗保護(hù)酶活性的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,29(2):18-23.

[8] Mohamed H B, Vadel A M, Geuns J M C, et al. Biochemical changes in dormant grapevine shoot tissues in response to chilling: possible role in dormancy release[J]. Scientia Horticulturae(Amsterdam), 2010, 124(4): 440-447.

[9] 陳建勛,王曉峰.植物生理試驗(yàn)指導(dǎo)[M].廣州:華南理工出版社,2013:78-80.

[10] 許維岸.生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].蘇州：蘇州大學(xué)出版社,2010：115-116.

[11] 張治安.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].長(zhǎng)春:吉林大學(xué)出版社,2008:192-193.

[12] 李合生.植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)[M].北京：高等教育出版社,2000:167-169.

[13] 郝再彬,蒼晶.植物生理實(shí)驗(yàn)[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社,2004:110-112.

[14] 高俊鳳.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2006：228-231.

[15] 楊東,張紅,陳麗萍,等．溫度脅迫對(duì)10種菊科雜草丙二醛和可溶性糖的影響[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,30(3):391-394.

[16] 李葉云,龐磊,陳啟文,等.低溫脅迫對(duì)茶樹葉片生理特性的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,40(4):134-138,145.

[17] 張靜,朱為民.低溫脅迫下番茄細(xì)胞膜保護(hù)酶活性的變化[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(6):121-124.

[18] 許桂芳,張朝陽(yáng),向佐湘,等.利用隸屬函數(shù)法對(duì)4種珍珠菜屬植物的抗寒性綜合評(píng)價(jià)[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào),2009,24(3):24-26.

[19] 田丹青,葛亞英,潘剛敏,等.低溫脅迫對(duì)3個(gè)紅掌品種葉片形態(tài)和生理特性的影響[J].園藝學(xué)報(bào),2011,38(6):1173-1179.

[20] 吳海寧,羅興錄,樊吳靜.低溫脅迫對(duì)不同木薯品種幼苗生理特性的影響[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2013,44(11):1791-1799.

[21] 余麗玲,何天友,陳凌艷,等.人工低溫脅迫下西洋杜鵑生理生化指標(biāo)的變化[J].農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),2014,4(1):48-53.

[22] 馬蘭濤,陳雙林,李迎春.低溫脅迫對(duì)Guaduaamplexfolia抗寒性生理指標(biāo)的影響[J].林業(yè)科學(xué)研究,2008(2):235-238.

[23] 熊燕,曲彥婷,唐煥偉,等.低溫脅迫及不同基質(zhì)對(duì)高山杜鵑生理和根系活力的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,44(10):117-121.

[24] Siddig K, Ebert G, Ladders P. Tamarind (TamarindusindicaL.): A review on a multipurpose tree with promising future in the Sudan[J]. Angewandte Botanik, 2012, 73(5/6): 202-205.