王麗，王振宇，2＊，樊梓鸞，左麗麗

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，哈爾濱 150090；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040）

樹莓也稱懸鉤子，懸鉤子屬是薔薇科（Rosaceae） 中的一個(gè)大屬，全世界已知有750余種，主要分布在北半球溫帶和寒帶，亞洲是世界樹莓屬中心。我國(guó)樹莓屬種類繁多，約有210多種，北到大興安嶺，南至海南，東至臺(tái)灣，西到新疆，均有分布，主要以長(zhǎng)江以南及西北地區(qū)多見(jiàn)，因其莖上有刺如懸鉤，故名之［1］。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，樹莓屬植物具有抗氧化、抗菌、抑癌、降糖、心血管保護(hù)等多種作用，其主要活性成分為多酚類化合物［2］。多酚（polyphenols）是植物代謝過(guò)程中的次生代謝產(chǎn)物。存在于許多水果、蔬菜以及各種香辛料、谷物、豆類、果仁中［3］。酚類化合物是一類具有大而復(fù)雜基團(tuán)的化合物，從化學(xué)上講多酚以苯酚為基本骨架，以苯環(huán)的多羥基取代為特征，主要由無(wú)色多酚和色素兩類物質(zhì)組成。從低分子量的簡(jiǎn)單酚類到分子量大至數(shù)千道爾頓的單寧類，按結(jié)構(gòu)可分為酚酸類（phenolic acids）、類黃酮類（flavonoids）及1，2－二苯乙烯（stilbenes）、花青素類和原花色素類等，目前已經(jīng)分離鑒定了8000多種多酚類物質(zhì)［4］。

常見(jiàn)水果中的總酚類化合物以游離和結(jié)合兩種形式存在，其中結(jié)合型約占24%，主要是游離型。資料報(bào)道用丙酮提取的蘋果總酚類化合物中游離型占91.8%，結(jié)合型為8.2%，因此通常用丙酮提取游離型酚類和類黃酮［5－6］。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樹莓，購(gòu)買于黑龍江省哈爾濱市。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

九陽(yáng)料理機(jī)；高剪切分散乳化機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；722可見(jiàn)分光光度計(jì)；電子天平；架盤藥物天平。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樹莓總多酚的提取工藝流程

樹莓（鮮果）→80%冷凍的丙酮（W／V，1／2），榨汁機(jī)勻漿（3min）→均質(zhì)機(jī)均質(zhì)（3min）→布氏漏斗抽濾→將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮→蒸餾水定容→含多酚的粗提物

操作要點(diǎn)：稱取凍存的鮮果，以1／2的料液比加入80%的丙酮，榨汁勻漿3min，在16000rpm轉(zhuǎn)速下均質(zhì)3min，用布氏漏斗抽濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀以轉(zhuǎn)速30r／min，溫度45℃，濃縮，用蒸餾水定容，獲得的粗提物溶液放在－20℃保存［7］。

1.3.2 總多酚的含量測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)用福林酚法測(cè)定總多酚的含量。

稱取沒(méi)食子酸50mg溶解于10mL乙醇（100%），即為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液。將標(biāo)準(zhǔn)母液分別稀釋成0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35和0.4mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取125μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入125μL FCR混合靜置6min，加入7%Na2CO3（1.25mL），用水調(diào)至3mL（加水1.5mL），放置90min，760nm測(cè)定吸光度［8］，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：取一定量樹莓提取液，蒸餾水稀釋10倍。取稀釋后的溶液125μL，按上述步驟操作測(cè)定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算總多酚含量。

總多酚含量（mg／100g）＝回歸濃度×稀釋倍數(shù)×提取液體積／原料鮮重／100

1.3.3 體外抗氧化的測(cè)定

1.3.3.1 清除 ABTS自由基能力

在734nm下，稀釋ABTS母液至A0＝0.700～0.800，然后將稀釋的樣品0.1mL與1.4mL稀釋后的ABTS混合，暗處反應(yīng)6min，在734nm下測(cè)定不同梯度樣品的吸光度A［9］。Trolox為陽(yáng)性對(duì)照。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.2 清除DPPH自由基能力

取4.7g DPPH，加入100mL無(wú)水乙醇溶解（吸光度 A0＝0.700～0.800），將不同梯度的樣品稀釋液0.1 mL與1.4mL DPPH暗處反應(yīng)30min后，在517nm下測(cè)定吸光度A。Trolox為陽(yáng)性對(duì)照［10］。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.3 清除羥基自由基能力

在反應(yīng)管中依次加入0.2mL樣品，0.8mL FeSO4（500μM），0.2mL EDTA （1mM），0.2mL H2O2（10mM），0.2mL 2－脫氧核糖（15mM），在37℃下反應(yīng)30min，然后加入1.4mL TCA－TBA－HCl混合溶液，沸水浴15min，迅速冷卻后，在532nm下測(cè)定吸光度A?？瞻撞患尤隖eSO4和H2O2，標(biāo)準(zhǔn)管用蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0［11］。抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照。

清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

1.3.3.4 清除超氧陰離子自由基能力

樣品管中依次加入1mL Tris－HCl（16mmol／L，pH＝8.0），0.5mL NADH（600μg／mL），0.6mL NBT（410μg／mL），0.2mL樣品溶液，加入 0.2mLPMS（138μg／mL）后，室溫反應(yīng)5min，在560nm處測(cè)定吸光度A?？瞻撞患覲MS，標(biāo)準(zhǔn)管用蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0［12］?？箟难釣殛?yáng)性對(duì)照。清除能力（%）＝（1－A／A0）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 總多酚含量測(cè)定

圖1 福林酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線

測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，回歸方程見(jiàn)式（2－1），方程的擬和度R2≈0.9994。

式中：y—溶液在760nm處的吸光度；

x—溶液中的沒(méi)食子酸含量（mg／mL）。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得樹莓的總多酚含量為708.54mg／100g鮮果。

2.2 體外抗氧化的測(cè)定

2.2.1 清除 ABTS自由基

ABTS二銨鹽與過(guò)硫酸銨反應(yīng)生成藍(lán)綠色ABTS＋·，在734nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí)，溶液顏色變淺，最大吸收波長(zhǎng)處的吸收減弱。

IC50值即清除50%自由基時(shí)，所需要的樣液的濃度。故IC50值越小，樣液清除自由基能力越強(qiáng)。

如圖2所示，樹莓提取液對(duì)ABTS自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，Trolox亦之。樹莓提取液對(duì)ABTS自由基的半清除率IC50為5.04mg／mL，Trolox對(duì)ABTS自由基的半清除率IC50為70.84mg／mL。說(shuō)明相同條件下，樹莓提取物比Trolox清除ABTS自由基的能力強(qiáng)。

圖2 清除ABTS自由基能力

2.2.2 清除DPPH自由基

圖3 清除DPPH自由基能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，其乙醇溶液呈紫色，并在517nm處有強(qiáng)烈吸收，在有自由基清除劑存在時(shí)，自由基清除劑提供一個(gè)電子與DPPH的孤對(duì)電子配對(duì)而使其褪色，褪色程度與其接受的電子呈定量關(guān)系，在517nm處的吸光度變小，其變化程度與自由基清除程度呈線形關(guān)系，即自由基清除劑的清除自由基能力越強(qiáng)，吸光度越小。

如圖3所示，樹莓提取液對(duì)DPPH自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，Trolox亦之。樹莓提取液對(duì)DPPH自由基的半清除率IC50為9.54mg／mL，Trolox對(duì)DPPH自由基的半清除率IC50為89.39mg／mL。說(shuō)明相同條件下，樹莓提取物比Trolox清除DPPH自由基的能力強(qiáng)。

2.2.3 清除羥基自由基能力

α－脫氧核糖法評(píng)價(jià)清除·OH－－能力是基于Fenton反應(yīng)，其原理如下：

采用亞鐵離子催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生羥自由基（Fenton反應(yīng)），當(dāng)反應(yīng)體系中存在自由基清除劑時(shí)，·OH－被部分清除，丙二醛生成量減少，粉紅色化合物生成量減少，532nm下吸收減弱。

如圖4所示，樹莓提取液對(duì)羥自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，抗壞血酸亦之。樹莓提取液對(duì)羥自由基的半清除率IC50為3.85 mg／mL，抗壞血酸對(duì)羥自由基的半清除率IC50為3.14 mg／mL，表明相同條件下，樹莓提取物與抗壞血酸清除羥自由基的能力接近。

圖4 清除羥自由基能力

2.2.4 清除超氧陰離子自由基能力

在堿性條件下，PMS催化NADH產(chǎn)生·O2－，在反應(yīng)體系中加入NBT可產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)體系中加入抗氧化劑時(shí)，·O2－被部分清除，與NBT產(chǎn)生的藍(lán)色物質(zhì)的量減少，因此通過(guò)反應(yīng)體系的吸光度值變化可測(cè)定此化合物清除·O2－的能力，間接反映出抗氧化劑的抗氧化活性。

如圖5所示，樹莓提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)，具有明顯的量效關(guān)系，抗壞血酸亦之。樹莓提取液對(duì)超氧陰離子自由基的半清除率IC50為11.96mg／mL，當(dāng)提取液濃度為40mg／mL時(shí)，清除率可達(dá)到94.74%。相同條件下，抗壞血酸對(duì)超氧陰離子自由基的半清除率IC50為4.77mg／mL，表明，樹莓提取液具有較好的清除超氧陰離子自由基的能力。

圖5 清除超氧陰離子自由基能力

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑提取法，得到樹莓總多酚含量為708.54mg／100g鮮果。

通過(guò)測(cè)定清除ABTS、DPPH、·OH－、·O2－自由基，4個(gè)指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)樹莓提取物的體外抗氧化能力。

3.1 隨樹莓提取液的濃度增加，抗氧化能力越強(qiáng)。而且樹莓提取液對(duì)ABTS自由基比較敏感，濃度為5.04 mg／mL時(shí)，清除率就可以達(dá)到50%。對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng)，濃度為9.54mg／mL時(shí)，清除率就可以達(dá)到50%。而且樹莓提取液對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基的清除作用要比Trolox的作用強(qiáng)，高約10倍。

3.2 樹莓提取液清除羥自由基的能力較強(qiáng)，濃度為3.85mg／mL時(shí)，清除率就可以達(dá)到50%，與抗壞血酸的清除能力相近。對(duì)超氧陰離子的清除能力也較強(qiáng)，濃度為11.96mg／mL時(shí)，清除率就可以達(dá)到50%。

總體來(lái)講，樹莓提取液對(duì)非生理性自由基有很強(qiáng)的清除作用，而對(duì)生理性自由基的清除能力不如抗壞血酸，但上述結(jié)論充分證明其具有較強(qiáng)的抗氧化作用，這可能與樹莓中含有大量的多酚有關(guān)。醫(yī)學(xué)研究表明，多酚類化合物通過(guò)清除自由基，能對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象，防止輻射誘發(fā)的DNA斷裂［13］，對(duì)自由基引起的疾病有很好的預(yù)防作用，因此多酚化合物又可叫做自由基吸收劑。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)于利用樹莓開發(fā)天然抗氧化功效因子提供了依據(jù)。但由于本研究?jī)H是在體外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，而生物體內(nèi)的氧化代謝是很復(fù)雜的，因此，還有待于從生物體內(nèi)源抗氧化酶系活性和生物大分子氧化代謝產(chǎn)物水平的角度來(lái)進(jìn)一步研究樹莓的抗氧化作用。

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