張凌云,徐成剛,張 斌,張建民,郭莉莉,趙 靜,周素明,廖 明

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病防控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510642;2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海 西寧 810016)

副豬嗜血桿菌(HPS)是巴斯德桿菌科(Pasteurellaceae)嗜血桿菌屬(Haemophilus)的一種豬的專性病原菌,可引起豬多發(fā)性漿膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等疾病,又稱豬格拉氏病[1]。隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展,該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的一種重要細(xì)菌性疾病。據(jù)Kielstein P(1992)報(bào)道,副豬嗜血桿菌存在15個(gè)血清型[1],除此之外,還存在很多血清型不定的菌株。由此可見,副豬嗜血桿菌菌株間的差異非常大,僅利用血清分型的手段不僅操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且不能滿足目前廣為流行的副豬嗜血桿菌病的流行病學(xué)研究的要求?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)特別是PCR技術(shù)的產(chǎn)生,為細(xì)菌流行病學(xué)的研究帶來了新的思路,它可對(duì)臨床和環(huán)境分離菌株進(jìn)行鑒定、遺傳多樣性分析及克隆傳播的監(jiān)測(cè)。目前,用于副豬嗜血桿菌的分型研究和流行病學(xué)調(diào)查的方法,有限制性內(nèi)切酶指紋圖譜[2]、限制性片段長度、多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[3]和腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR,ERIC-PCR)等[4-6]。

腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是根據(jù)不同的細(xì)菌基因組上的保守重復(fù)序列的數(shù)目和分布不同,而擴(kuò)增出由一系列大小不同片段組成的DNA指紋圖譜。該方法以細(xì)菌整個(gè)染色體為研究對(duì)象,能夠在基因組水平上準(zhǔn)確反映菌體之間的差異,具有便于操作、特異性強(qiáng)、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn),因此也被應(yīng)用于副豬嗜血桿菌的分子分型及流行病學(xué)的研究[4-6]。

本文采用ERIC-PCR方法以15株不同血清型的副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為參照,對(duì)2009～2010年間分離自華南地區(qū)的41株副豬嗜血桿菌分離株進(jìn)行分子分型,以期了解近兩年華南地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的遺傳演化特性及流行特點(diǎn),為華南地區(qū)副豬嗜血桿菌病的研究積累重要的流行病學(xué)資料,為更好地防控該病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 41株副豬嗜血桿菌分離株分離自2009年和2010年華南地區(qū)33個(gè)疑似副豬嗜血桿菌病的豬群,由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存,15株參考株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)陳煥春院士惠贈(zèng)。本試驗(yàn)所有的副豬嗜血桿菌均利用加有20μg/m L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(Sigma公司)和5%滅活新生牛血清的胰酪蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)(Oxoid)進(jìn)行培養(yǎng),含有5%CO2,37°C 培養(yǎng) 16～24 h。

1.2 方法

1.2.1 血清型鑒定 分離菌株的血清型根據(jù)Kielstein-Rapp-Gabrielson(KPG)方法[1]進(jìn)行鑒定,即用參考菌株制備15個(gè)血清型的抗血清,并用瓊脂擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)對(duì)41株分離株的血清型進(jìn)行鑒定。

1.2.2 DNA制備 取副豬嗜血桿菌分別接種在加有20μg/m L NAD和5%滅活新生牛血清的TSA培養(yǎng)基上復(fù)蘇,37℃含5%CO2的環(huán)境中過夜培養(yǎng),收獲菌體,用DNA少量提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.3 ERIC-PCR PCR 引 物 :ERIC-1R(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGA TTCAC-3′),ERIC-2(5′-AAGTAAG TGACTGGGGTGAGCG-3′)參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[9],由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系:1μL Taq DNA聚合酶(Invitrogen),2.5μL 10×PCR Buffer,1μL dN TP,1 μL ERIC-1R,1 μL ERIC-2,200 ngDNA 模板 ,加無菌去離子水到25μL體系。同時(shí)以去離子水作模板設(shè)陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,55℃復(fù)性 40 s,72℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10 min。

1.2.4 DNA指紋圖譜的分析 ERIC指紋圖譜用BioNumerics 5.1數(shù)據(jù)庫軟件處理,進(jìn)行條帶數(shù)目、亮度和聚類分析(UPGMA)后產(chǎn)生樹狀圖。并用鑒別指數(shù)DI對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ERIC-PCR結(jié)果 15株副豬嗜血桿菌參考株ERIC-PCR結(jié)果見圖1。從圖中可以看出對(duì)15株副豬嗜血桿菌參考菌株進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增后,圖譜條帶清晰,經(jīng)肉眼觀察14型和15型似乎具有相同的指紋圖譜,經(jīng) BioNumerics軟件分析血清型1～15的參考菌株都具有各自特異的指紋圖譜,且指紋圖譜具有可重復(fù)性。

圖1 副豬嗜血桿菌參考菌株指紋圖譜

2.2 ERIC-PCR電泳圖譜分類鑒定及聚類分析用BioNumerics5.1軟件用對(duì)電泳圖譜進(jìn)行分類鑒定和聚類分析(UPGMA)后產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化樹狀圖(見表1、圖2)。從結(jié)果可看出,56株菌的指紋圖譜多態(tài)性較高,共產(chǎn)生41個(gè)ERIC基因型,占優(yōu)勢(shì)的ERIC基因型為 E28(4/56)、E19(4/56)和 E31(4/56)。其中15株參考菌株具有各自獨(dú)特的指紋圖譜,41株分離株產(chǎn)生了26種不同的指紋圖。從圖2可看出,56株副豬嗜血桿菌可聚集成A、B、C三個(gè)群,其中B群為優(yōu)勢(shì)群。血清型和ERIC基因型間沒有必然的聯(lián)系,但血清5型和血清12型的菌株有聚集的現(xiàn)象,集中在B群。

表156 株副豬嗜血桿菌血清型和ERIC分型

3 討論

目前,我國副豬嗜血桿菌病的發(fā)病率以及該病帶來的經(jīng)濟(jì)損失都呈上升趨勢(shì)[7]。由于受到環(huán)境、藥物及動(dòng)物本身狀態(tài)等因素的影響,副豬嗜血桿菌的遺傳物質(zhì)也發(fā)生了相應(yīng)變化,產(chǎn)生了新的基因特征,使得副豬嗜血桿菌的指紋圖譜呈現(xiàn)較高的多態(tài)性。為此,本文對(duì)華南地區(qū)2009～2010年分離的41株副豬嗜血桿菌和15株參考株的基因型進(jìn)行了ERIC-PCR指紋圖譜鑒定、比較和分析,擬確定華南地區(qū)近兩年流行的ERIC基因型,以期了解華南地區(qū)副豬嗜血桿菌的流行情況和變化趨勢(shì)。

從筆者對(duì)副豬嗜血桿菌ERIC指紋圖譜的分析發(fā)現(xiàn),41株分離株都具有特異的 ERIC指紋圖譜,且應(yīng)用血清學(xué)分型方法未能分型的 4株菌株(SC006、SC019、SC053、SC108),通過 ERIC-PCR方法均能分型,從而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)血清分型[1]方法的缺陷。

筆者認(rèn)為ERIC-PCR分型方法、血清分型和流行病學(xué)資料相結(jié)合有利于對(duì)副豬嗜血桿菌進(jìn)行流行病學(xué)研究。如19株來自廣東三水地區(qū)的菌株可分為8個(gè)ERIC基因型和5個(gè)血清型,還有3株未被定為任一血清型。普遍流行的ERIC基因型有E28(4/19),E31(4/19),E19(3/19),且可看出該基因型的菌株有血清2、5、12、15型,這些血清型的菌株都被預(yù)測(cè)為具有強(qiáng)毒力或中等毒力,因此,推測(cè)E28、E31和E19基因型的菌株為廣東三水地區(qū)發(fā)生格拉氏病的常見菌型。據(jù)此可有針對(duì)性地采取防控措施,防止副豬嗜血桿菌病的發(fā)生和病原的傳播。本試驗(yàn)是繼李鵬等[6].對(duì)2003～2008年部分地區(qū)分離的副豬嗜血桿菌ERIC基因分型的后續(xù)研究,以對(duì)近兩年華南地區(qū)副豬嗜血桿菌流行菌株的情況進(jìn)行及時(shí)監(jiān)測(cè),使副豬嗜血桿菌流行病學(xué)資料具有延續(xù)性。

本試驗(yàn)以生物學(xué)信息管理軟件BioNumerics 5.1對(duì)生物學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過辛普森多樣性指數(shù)計(jì)算其鑒別能力得出,ERIC-PCR能夠?qū)⑦z傳上不相關(guān)的副豬嗜血桿菌菌株鑒別開來,且具有較高的鑒別率,為0.984;高于在巴西[5]分離株分型運(yùn)用中的0.960的鑒別率。此外,對(duì)來自5個(gè)豬場(chǎng)的13株副豬嗜血桿菌的基因相關(guān)性的試驗(yàn)表明,ERICPCR方法具有種系間相關(guān)性的鑒別能力。例如,來自三水A場(chǎng)的菌株SC021和SC022同為ERIC E8型;來自三水C場(chǎng)的菌株SC107,SC108,SC109同為ERIC E19型;來自三水E場(chǎng)菌株SC001,SC009,SC016和SC020同為ERIC E28型。來自廣東肇慶B場(chǎng)菌株SC058和SC059同為ERIC E10;來自云浮D場(chǎng)SC051和SC053同為ERIC E25型。而大部分來自不同地區(qū)的菌株指紋圖譜有差異,這和Rafiee M等[4]的報(bào)道相一致。

圖2 副豬嗜血桿菌15種血清型參考菌株和41株分離株ERIC-PCR聚類分析

ERIC-PCR具有簡單、快速、成本低,對(duì)操作和試劑以及儀器要求都不高的特點(diǎn),只需要1臺(tái)PCR儀就可完成對(duì)菌株的基因型的鑒定[7]。對(duì)于預(yù)測(cè)副豬嗜血桿菌菌株的流行趨勢(shì),探究其感染源和傳播途徑等有重要的指導(dǎo)意義。

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