白立景,鞠輝明,牟玉蓮,楊述林,李 奎,陳明勇

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 海淀 100193)

植酸酶(phytases)是廣泛存在于動(dòng)植物及多種微生物中的一種磷酸酶,可以催化植酸(肌醇六磷酸)和植酸鹽水解成肌醇和磷酸(或磷酸鹽)。自然界中,豆類等油料作物及谷物中的植酸是磷的主要存儲(chǔ)形式,由于一些單胃動(dòng)物缺少植酸酶而不能利用這些形式的磷,所以只能通過在飼料中添加無機(jī)磷來滿足正常生長及代謝需要,而動(dòng)物體內(nèi)的植酸磷不能利用而通過糞便排出體外,造成磷資源的浪費(fèi)和環(huán)境的磷污染。通過在畜禽飼料中添加植酸酶促進(jìn)植酸磷的利用是國內(nèi)外普遍采用的手段[1]。生產(chǎn)中應(yīng)用的植酸酶大多通過工程菌產(chǎn)生,按照目前的技術(shù)體系,很難在短時(shí)間內(nèi)通過工程菌的方法大幅度提高表達(dá)效率,因此利用真核表達(dá)系統(tǒng),通過哺乳動(dòng)物的生物反應(yīng)器制備植酸酶是一個(gè)高效低成本的方法[2]。本試驗(yàn)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從大腸桿菌中擴(kuò)增得到植酸酶ap p A2基因,構(gòu)建了app A2基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ap p A2,并在豬 PK15細(xì)胞進(jìn)行了初步表達(dá),為通過生物反應(yīng)器制備植酸酶研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1(+)質(zhì)粒、DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、埃希大腸桿菌菌株、PK15細(xì)胞系,由本院保存。Liperfectamine 2000購自Invitrogen生物公司;胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自GIBCOL BRL公司;限制性內(nèi)切酶 HindⅢ、EcoRⅠ購自Fermantas公司;Ex-Tag E及定量PCR試劑購自寶生物工程(大連)有限公司;T 4 DNA連接酶購自Promega公司;植酸鈉購于Sigma公司。

1.2 pcDNA-app A2真核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)公布的植酸酶app A2基因序列,設(shè)計(jì)并合成1對(duì)引物P1及P2,并在引物中設(shè)計(jì)HindⅢ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(劃線部分),以埃希大腸桿菌中為模板,用高保真酶擴(kuò)增植酸酶app A2基因,按常規(guī)方法組成總反應(yīng)體系,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?98℃10s,68℃2 min,循環(huán)30次。引物序列如下:

PCR產(chǎn)物鑒定純化后用Hin dⅢ、Eco RⅠ雙酶切,同時(shí)用 Hin dⅢ、Eco RⅠ雙酶切 pcDNA3.1(+)載體,將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切后的載體連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌,挑選單個(gè)菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,得到重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ap p A2,而后進(jìn)行PCR和酶切鑒定;同時(shí)將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.3 pcDNA-app A2載體的細(xì)胞水平表達(dá)檢驗(yàn)以pcDNA3.1(+)質(zhì)粒為對(duì)照,分別將pcDNA和pcDNA-ap p A2質(zhì)粒用S ca I酶切線性化后純化,進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,經(jīng)G418篩選,3周后擴(kuò)大培養(yǎng),部分細(xì)胞用以測(cè)定細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性,部分細(xì)胞提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以此為模板,以豬GAPD H基因?yàn)閮?nèi)參(引物為 GAPDH-L1和GAPDHR1),進(jìn)行熒光定量PCR,測(cè)定 ap p A2表達(dá)量(引物為 app A2-RT L1和 ap p A2-RTR1)。按照 ABI定量試劑說明書進(jìn)行,PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5℃5 min;94℃20 s,退火溫度56℃30 s,72℃1 min,循環(huán) 40次,72℃延伸5 min。引物見下:

1.4 細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性的測(cè)定 分別收集試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞并計(jì)數(shù),反復(fù)凍融,破碎細(xì)胞,離心,收集細(xì)胞上清即為酶粗提液,調(diào)節(jié)p H值為5.5,采用文獻(xiàn)[3]改進(jìn)的鉬酸銨顯色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性。植酸酶活性以相對(duì)OD值表示,重復(fù)2～3次。本試驗(yàn)中酶活性單位定義為在37.0℃、p H值5.50條件下,每分鐘從0.005 mol/L的植酸鈉溶液中釋放出1μmol/L的無機(jī)磷所需要的酶量,即為1個(gè)酶活單位,以FTU/μL表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pcDNA-app A2真核表達(dá)載體的構(gòu)建 從大腸桿菌提取總RNA,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查,得到一條約1.3 kb的特異性片段(圖1),與預(yù)期結(jié)果基本一致。用質(zhì)粒提取試劑盒提取 pcDNA-app A2重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng) Hin dⅢ、Eco RⅠ雙酶切鑒定,可見在約5.4 kb和1.3 kb處各出現(xiàn)一條目的條帶,5.4 kb的目的條帶為pcDNA3.1(+)載體,均和預(yù)期目的條帶大小基本一致(圖2)。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)全自動(dòng)測(cè)序,鑒定結(jié)果與Gen Bank登錄序列完全一致,表明pcDNA-app A2重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.2 pcDNA-app A2載體的細(xì)胞水平表達(dá)檢驗(yàn) 圖3為熒光定量PCR儀顯示結(jié)果,其中縱坐標(biāo)以log10值為單位,各組值為每組目的基因表達(dá)水平和內(nèi)參表達(dá)水平的比值。以對(duì)照組細(xì)胞相應(yīng)基因表達(dá)為參照基數(shù)1,試驗(yàn)組表達(dá)水平值為對(duì)照組相應(yīng)基因表達(dá)的倍數(shù)。檢測(cè)結(jié)果表明,構(gòu)建的重組表達(dá)載體能有效表達(dá)外源基因app A2。以對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)appA2表達(dá)量為基準(zhǔn)(log0=1),重組表達(dá)載體組表達(dá)量是對(duì)照組的1686.55倍(圖3)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性的測(cè)定 采用改進(jìn)的鉬酸銨顯色法測(cè)定植酸酶活性,首先由磷標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程為y=0.2783x+0.0842,回歸系數(shù)為R2=0.9942。對(duì)照磷標(biāo)準(zhǔn)曲線,重組表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性分別為0.239、0.221 FTU/μL及0.244 FTU/μL,對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性為0.082、0.075 FTU/μL及 0.088 F TU/μL,兩組分別平均為0.235±0.023 F TU/μL及0.082±0.015 FT U/μL,兩者差異極顯著(P＜0.01)文藝(圖4),表明我們制備的pcDNA-ap p A2真核表達(dá)載體能有效表達(dá)植酸酶基因,并且具有好的植酸酶活性。

圖4 細(xì)胞內(nèi)植酸酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

植酸酶已被公認(rèn)為一種新型營養(yǎng)型飼料添加劑,生產(chǎn)中用植酸酶代替飼料中添加的無機(jī)磷,能使動(dòng)物磷排泄量減少,同時(shí)能增加動(dòng)物對(duì)飼料中蛋白質(zhì)、脂肪及微量元素和維生素的利用率[10],因此植酸酶作為動(dòng)物飼料添加劑在生產(chǎn)中需求量非常大,但植酸酶在天然材料中表達(dá)量低而且活性也很低,很難滿足生產(chǎn)需要。近年來利用生物工程技術(shù)對(duì)植酸酶進(jìn)行了改造,通過多種微生物[4-6]等作為植酸酶的表達(dá)系統(tǒng)取得了很大的進(jìn)展,但每一類表達(dá)系統(tǒng)都有其自身特點(diǎn)和不足[4]。目前植酸酶的生產(chǎn)和應(yīng)用主要面臨3個(gè)主要問題:一是生產(chǎn)中尚未獲得具有商業(yè)價(jià)值耐高溫的植酸酶,因?yàn)橹苽漕w粒飼料時(shí)高溫處理是必需的技術(shù)環(huán)節(jié);二是植酸酶的pH值使用范圍窄,很難適應(yīng)動(dòng)物胃內(nèi)的酸性環(huán)境;三是植酸酶作為飼料添加劑必須抵抗胃腸道內(nèi)的多種蛋白酶的水解作用。上述3個(gè)問題大大降低了植酸酶的利用率,因此通過構(gòu)建植酸酶真核表達(dá)載體在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)植酸酶基因,有望避免植酸酶作為飼料添加劑時(shí)遇到的上述困難。

目前,已有眾多試驗(yàn)研究從土壤和水體中的真菌及細(xì)菌基因組序列中克隆出植酸酶基因,單植酸酶的比活力相差很大。其中,來自埃希氏大腸桿菌的植酸酶是目前發(fā)現(xiàn)的比活性最高的植酸酶,在已知植酸酶中是具有廣泛應(yīng)用前景的一種[5]。試驗(yàn)結(jié)果表明,我們已成功構(gòu)建植酸酶ap p A2基因真核表達(dá)載體,為下一步通過生物反應(yīng)器制備植酸酶奠定了基礎(chǔ)。

[1] Lei X G,Ku P K,Miller E R,etal.Supplementing corn-soybean meal diets w ith microbial phytase lin early improves phy tate phosphoru s u tilization by w ean ling pig s[J].J Anim Sci,1993,71(12):3359-3367.

[2] Clark A J.T he m amm ary gland as a bioreactor:exp ression,processing,and production of recombinan t protein s[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,1998,3(3):337-350.

[3] 譚寶玲,陳靜,馮建文.植酸酶活性測(cè)定方法[J].廣東飼料,2006,15(5):43-44.

[4] Haefner S,Knietsch A,S cholten E,et al.Biotechn ological production and applications of phytases[J].Ap pl Microbiol Biotechnol,2005,68(5):588-597.

[5] Mik sch G,Kleist S,Friehs K,et al.Overex pression of the phy tase from Escherichia coli and its extracellular p roduction in bioreactorS[J].Appl Microbiol Biotechnol,2002,59(6):685-694.

[6] T ran T T,M am o G,Mattiasson B,et al.A thermostable phy tase from Bacillus sp.MD2:cloning,ex pression and highlevel production in E scherichia coli[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2009,146(2):468-477.