李金紅，劉迎九，張國娟，尹洪超，陶建瓴，李 航

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

2北京同仁醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100730

3中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所病理系，北京 100005

雷帕霉素在臟器移植術后抗排斥治療［1－6］、腫瘤治療［7］及預防冠脈支架形成術后再狹窄［2，8］等方面的有效作用使之已成功地應用于臨床。高脂血癥是雷帕霉素最主要的副作用，主要表現(xiàn)為高膽固醇血癥和高三酰甘油血癥［9－11］。雷帕霉素在脂質代謝上表現(xiàn)出雙面性:抗動脈粥樣硬化和引起高脂血癥這兩個相矛盾的作用同時發(fā)生在雷帕霉素用藥過程中。雷帕霉素可通過抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移、減少前炎癥因子的表達、減少動脈單核細胞趨化因子－1的表達發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，但雷帕霉素引起高脂血癥的機制，目前尚不十分清楚。脂肪細胞的分化成熟及其儲脂功能受人雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mTOR)調控，阻斷mTOR能阻斷脂肪細胞分化。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptor，PPAR) 家 族是動物糖脂代謝的主要核調節(jié)受體，其中PPARγ被認為是調節(jié)脂肪組織分化、抑制ob基因下調瘦素表達的主要核受體因子。3T3－L1前脂肪細胞系是較常用于研究脂肪分化及脂質代謝的細胞模型，它能在胰島素誘導下分化成為成熟的脂肪細胞，成熟后的3T3－L1具有儲存脂質及分泌瘦素、脂聯(lián)素的功能。本研究通過觀察雷帕霉素對3T3－L1前脂肪細胞分化、脂質蓄積的影響和與PPARγ表達變化之間的關系探討雷帕霉素引起高脂血癥的可能機制。

材料和方法

材料 小鼠3T3－L1前脂肪細胞株由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所病理系惠贈，雷帕霉素由華北制藥廠惠贈，膽固醇標準溶液和內(nèi)標物豆甾醇由北京醫(yī)院老年病研究所惠贈。胎牛血清、小牛血清和DMEM F12培養(yǎng)基購自HyClone公司，抗PPARγ抗體購自Abcam公司，二抗購自北京中杉金橋公司，瘦素、脂聯(lián)素Elisa試劑盒購自R＆D公司，牛胰島素、3－異丁基－l－甲基黃嘌呤和地塞米松購自Sigma公司，逆轉錄試劑盒購自Promega公司，實時熒光定量PCR試劑購自TOYOBO公司，引物由上海生物工程有限公司合成。其余化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

前脂肪細胞3T3-L1的培養(yǎng) 用含10%小牛血清DMEM F12細胞培養(yǎng)液在37℃、含5%CO2的孵箱中進行細胞培養(yǎng)傳代，3T3－L1前脂肪細胞的分化采用傳統(tǒng)的雞尾酒法:細胞培養(yǎng)至融合狀態(tài)2 d后，用10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，再先后用脂肪細胞分化液Ⅰ (含地塞米松 1 μmol/L、3－異丁基－l－甲基黃嘌呤11 ng/ml、胰島素10μg/ml的10%胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液)、Ⅱ (含胰島素10μg/ml的10%胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液)培養(yǎng)2 d，去除分化液后再用含10%胎牛血清的DMEM F12細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，至其成熟。以加分化液Ⅰ起，標記脂肪細胞為分化0 d，以此類推，分化8 d時3T3－L1細胞已基本達成熟狀態(tài)。

油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化 將細胞培養(yǎng)于6孔板，細胞培養(yǎng)至分化4 d時，加入含不同濃度的雷帕霉素 (0、50、100、200 nmol/L)的10% 胎牛血清DMEM F12培養(yǎng)液，每2天換1次含藥物的培養(yǎng)液，分化8 d時用于做油紅O染色，顯微鏡下觀察、照相。

高效液相色譜分析細胞內(nèi)膽固醇的變化 分化8 d時細胞成熟，用0.1 mol/L NaOH 200 μl反復凍融裂解細胞，平均分成2份，移入2支玻璃安珀內(nèi)，分別用于總膽固醇和游離膽固醇檢測，按照北京醫(yī)院老年病研究所膽固醇檢測方法［12］對樣品進行預處理，上樣于高效液相色譜儀，進樣30 μl，流動相為乙腈∶異丙醇 (90∶10)，流速1 ml/min，紫外250 nm檢測。將標準溶液濃度對膽固醇/內(nèi)標峰面積比進行線性回歸，得回歸方程。樣品/內(nèi)標峰面積比代入方程計算濃度，用蛋白濃度校正，單位為mg/g蛋白。以各組與對照組膽固醇濃度的比值進行統(tǒng)計學分析。

3T3-L1前脂肪細胞分泌功能的檢測 細胞培養(yǎng)在24孔板中，到分化8 d時收集細胞培養(yǎng)上清液600 μl，－80℃凍存。按照脂聯(lián)素、瘦素的ELISA試劑盒說明書進行樣本處理，酶標儀450 nm波長處檢測，用630 nm糾正;繪制標準曲線，以濃度的對數(shù)為橫坐標，光密度值/標準濃度光密度值為縱坐標，在對數(shù)坐標軸上繪制一條標準曲線，根據(jù)標準曲線得出各個樣品的脂聯(lián)素或瘦素的濃度，再進行統(tǒng)計學分析。

實時熒光定量PCR法分析3T3-L1細胞PPARγ mRNA的表達 至分化8 d時細胞成熟，收集細胞提取RNA，逆轉錄后做實時熒光定量PCR檢測，酶激活95℃ 3 min，擴增反應:95℃ 15 s變性，退火60℃ 15 s，延伸72℃ 15 s，40個循環(huán)。引物序列為PPARγ:正 義 鏈 5'－CCCTACCCACTTCCATTCCC－3'反義鏈 5'－CGATATTCACGATCACGGCTT－3';β－actin:正義鏈 5'－CATGTACGTTGCTATCCAGGC－3'，反 義 鏈 5'－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3'。

Western blot方法分析3T3-L1細胞PPARγ的蛋白表達 至分化8 d時細胞成熟，收集細胞提取總蛋白30μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將電泳分離后蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，經(jīng)封閉后加入PPARγ(1∶500)兔抗鼠多克隆抗體，用 β－actin(1∶1000)抗體做內(nèi)參，4℃孵育過夜，洗膜后用二抗 (1∶4000)室溫孵育1 h，電化學發(fā)光法顯影，用Image－Pro Plus圖像分析軟件分析蛋白條帶的積分光密度值 (integrated optical density，IOD)，IOD=平均光密度值×面積，以PPARγ IOD/β－actin IOD的比值反映蛋白相對表達水平。

阻斷或激活PPARγ對3T3-L1細胞PPARγ表達的影響 將細胞培養(yǎng)于6孔板，細胞培養(yǎng)至分化4 d時，分為雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑曲格列酮 (troglitazone，TZD)10 μmol/L處理組，用Western blot方法和實時熒光定量PCR方法測定細胞內(nèi)PPARγ蛋白和mRNA的表達，高效液相色譜法定量分析各組膽固醇濃度，ELISA法分析各組上清液中瘦素表達量變化。

統(tǒng)計學處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組實驗獨立重復3次，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，差異顯著性檢驗采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

細胞內(nèi)脂滴變化 雷帕霉素0、50、100、200 nmol/L處理3T3－L1細胞4 d后做油紅0染色，顯示雷帕霉素在50～200 nmol/L濃度內(nèi)均能抑制3T3－L1細胞內(nèi)脂質的形成 (圖1)。

圖1 油紅O染色顯示不同濃度雷帕霉素處理細胞成熟后蓄積脂滴的變化 (×400)Fig 1 Oil red O staining shows the changes of cholesterol accumulation after treatment with different concentration of rapamycin(×400)

膽固醇含量 對照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組細胞內(nèi)游離膽固醇含量分別為 (12.89±0.16)、(9.84±0.45)、(9.39±0.46)和(8.61±0.34)mg/ml，與對照組相比，雷帕霉素50、100、200 nmol/L細胞內(nèi)游離膽固醇蓄積減少 (P＜0.05)，細胞內(nèi)總膽固醇含量分別為 (12.91±0.50)、(9.94±0.96)、(10.45±2.51)和 (9.53±0.63)mg/ml，與對照組相比，雷帕霉素50、100、200 nmol/L組細胞內(nèi)總膽固醇蓄積減少 (P＜0.05)，50、200 nmol/L組差異亦有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

瘦素、脂聯(lián)素的分泌 對照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組瘦素分泌量分別為 (19.02±0.52)、(16.98±0.11)、(15.62±0.01)、(13.84±0.66)ng/ml，與對照組相比，雷帕霉素能減少成熟后3T3－L1脂肪細胞瘦素的分泌水平 (P＜0.05);對照組、雷帕霉素50、100、200 nmol/L組脂聯(lián)素分泌量分別為 (0.093±0.003)、(0.088±0.031)、(0.078±0.005)、 (0.078±0.016)ng/ml，與對照組相比，雷帕霉素未影響脂聯(lián)素分泌水平 (P＞0.05)。

PPARγ mRNA的表達 在作用3T3－L1細胞96 h后，雷帕霉素50、100及200 nmol/L組PPARγ mRNA表達量分別為對照組的 (0.93±0.14)、(0.62±0.10)和 (0.47±0.19)倍，均較對照組降低 (P＜0.05)，其中200 nmol/L作用最明顯。

PPARγ蛋白的表達 在作用3T3－L1細胞96 h后，雷帕霉素50、100及200 nmol/L組PPARγ蛋白表達量分別為對照組的 (0.80±0.12)、(0.74±0.11)和 (0.61±0.10)倍，均較對照組降低 (P＜0.05)(圖2)。

圖2 Western blot分析不同濃度雷帕霉素處理組3T3－L1細胞內(nèi)PPARγ的蛋白表達Fig 2 Western blot shows the protein expression of PPARγ in 3T3－L1 cells after treatment with different concentrations of rapamycin

阻斷或激活PPARγ對3T3-L1細胞PPARγ表達的影響 雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L 分別處理細胞96 h，檢測PPARγ mRNA的表達，分別為對照組的(0.60±0.14)、(0.67±0.03)和 (1.30±0.14)倍，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。各處理組PPARγ蛋白表達與 mRNA的表達變化趨勢相似，雷帕霉素 100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L處理組細胞內(nèi)PPARγ蛋白表達，分別為對照組的(0.74±0.11)、(0.57±0.23)和 (1.91±0.12)倍，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)(圖 3)。

圖3 Western blot檢測PPARγ阻斷或激活后蛋白的表達Fig 3 Western blot shows the PPARγ protein expression after 3T3－L1 is treated with PPARγ agonist or blocking agent

阻斷或激活PPARγ對3T3-L1細胞脂質蓄積量的影響 對照組、雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L 分別處理細胞96 h，高效液相色譜測定各組總膽固醇量分別為 (12.91±0.50)、(10.45±2.52)、(11.88±0.55)和 (13.27±0.71)mg/ml，游離膽固醇量分別為 (12.89±0.16)、 (9.39±0.46)、 (11.09±0.11)和 (11.83±0.47)mg/ml，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

阻斷或激活PPARγ對3T3-L1細胞分泌瘦素的影響 對照組、雷帕霉素100 nmol/L、PPARγ阻斷劑 GW966210 μmol/L、PPARγ 增敏劑 TZD 10 μmol/L分別處理細胞96 h，ELISA檢測各處理組瘦素表達量分別為 (19.02±0.52)、(15.62±0.10)、(14.45±1.01)和 (18.07±0.66)ng/ml，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)。

討 論

經(jīng)雷帕霉素的Ⅱ期臨床試驗驗證，雷帕霉素在聯(lián)合環(huán)孢素或者激素類使用時能發(fā)揮有效的免疫抑制效應，而且腎毒性、神經(jīng)毒性小，服用雷帕霉素的患者也不易有糖尿病傾向。然而，高脂血癥是雷帕霉素的嚴重的副作用，大約40%接受雷帕霉素治療的腎移植患者出現(xiàn)高脂血癥，主要表現(xiàn)為膽固醇、三酰甘油在用藥期間明顯上升，同時伴有載脂蛋白Apo－B100、ApoC－Ⅲ的升高，高血脂一般在患者用藥2～3個月后達頂峰，而且具有劑量和濃度依賴性，當患者三酰甘油或膽固醇分別升到0.3或0.2 mg/L時需要利用藥物進行控制［13］。雷帕霉素顯著延遲血液中低密度、中密度、極低密度脂蛋白的清除，還可以加重神經(jīng)鈣調蛋白抑制劑和類固醇激素誘發(fā)的高三酰甘油血癥，它使慢性腎臟疾病患者的血脂代謝障礙變得更難處理。有關雷帕霉素引起高脂血癥機制的研究尚未深入。

脂肪組織是體內(nèi)最大的膽固醇儲存庫，脂肪組織的數(shù)目以及脂肪細胞內(nèi)所含的三酰甘油的量決定了細胞內(nèi)膽固醇的含量［14］。脂肪細胞內(nèi)膽固醇的平衡又直接影響到整個機體的膽固醇穩(wěn)態(tài)［15－16］，在某些病理狀態(tài)下脂肪組織細胞數(shù)目減少、儲存脂質能力降低將造成體內(nèi)血脂含量的上升。脂肪組織合成多種載脂蛋白、脂蛋白受體，也是脂蛋白脂酶合成的主要部位，是血脂代謝調控的重要樞紐。細胞水平研究顯示，雷帕霉素能減少原代培養(yǎng)脂肪細胞內(nèi)脂滴數(shù)量［17］。本研究顯示，雷帕霉素能抑制3T3－L1前脂肪細胞分化成熟，雷帕霉素處理組細胞內(nèi)脂滴變小，脂質總蓄積量減少;定量檢測細胞內(nèi)膽固醇蓄積量顯示，游離膽固醇的劑量依賴性地減少，表明雷帕霉素能抑制脂肪細胞脂質蓄積，減少細胞內(nèi)游離膽固醇含量。

脂肪組織不僅參與能量、脂質代謝，同時是重要的分泌器官，成熟的脂肪細胞可以通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的方式分泌瘦素、脂聯(lián)素及抵抗素、腫瘤壞死因子、白介素－6、等重要的脂質代謝調節(jié)因子。瘦素是成熟脂肪細胞分泌的一種重要激素，通過作用于下丘腦厭食中樞負向調節(jié)機體攝食和能量消耗，促進脂肪水解降低體內(nèi)的血脂水平［18］。瘦素水平與空腹胰島素水平及體重指數(shù)正相關，是1型糖尿病和肥胖的重要生理指標之一，其與ApoB/A1比例有明顯相關性，而后者是腹型肥胖及兒童代謝綜合征的獨立危險因素。瘦素的分泌受磷脂酰肌醇－3激酶信號途徑和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體－1調控，而雷帕霉素作為mTOR抑制劑，多數(shù)作用均是通過抑制mTOR及其下游的p70S6K和4EBP1蛋白實現(xiàn)的。本研究顯示，雷帕霉素能劑量依賴性地抑制瘦素的分泌水平。脂聯(lián)素也是成熟脂肪細胞分泌的調節(jié)糖脂代謝的重要激素，脂聯(lián)素的分泌水平不同于脂肪組織分泌的其他激素，肥胖的患者血清脂聯(lián)素水平降低，體重減輕后脂聯(lián)素分泌水平增加。脂聯(lián)素增加內(nèi)臟脂肪組織體積與腹型肥胖相關，是代謝綜合征的一個重要分子標志物，同時脂聯(lián)素又有增加胰島素敏感性、抗動脈粥樣硬化及抗炎癥的作用。但本研究脂聯(lián)素的表達水平并未受雷帕霉素的影響，推測脂聯(lián)素的分泌可能不依賴于mTOR 激酶活性。Blümer等［19］認為脂聯(lián)素的分泌受磷脂酰肌醇－3激酶活性及酸性溶酶體pH值調節(jié)，推測可能脂聯(lián)素的分泌并不受mTOR信號通路影響。

PPARγ是脂肪細胞分化成熟的關鍵因子，和轉錄調節(jié)因子 (C/EBP－α)形成正反饋環(huán)激活維持脂肪細胞功能的各種酶類直到其分化成熟。本研究在用PPARγ阻斷劑GW9662部分阻斷 PPARγ的表達后，3T3－L1細胞內(nèi)蓄積的膽固醇、分泌的瘦素量均減少;而用曲格列酮激動PPARγ脂質的蓄積量和瘦素的表達均有所上升。表明PPARγ影響3T3－L1前脂肪細胞分化成熟及分泌功能。雷帕霉素能劑量依賴性地抑制3T3－L1前脂肪細胞內(nèi)PPARγmRNA和蛋白的表達且對3T3－L1前脂肪細胞的分化成熟和分泌。

功能的影響與GW9662的作用相似，推測雷帕霉素能通過抑制PPARγ從而減少3T3－L1脂肪細胞內(nèi)的脂質蓄積及瘦素分泌，而脂肪細胞蓄積脂質減少和分泌瘦素減少均能影響體內(nèi)血脂平衡，這也為雷帕霉素引起的高脂血癥提供一個可能的解釋。

［1］Sehgal SN.Rapamune(RAPA，rapamycin，sirolimus):mechanism of action immunosuppressive effect results from blockade of signal transduction and inhibition of cell cycle progression ［J］.Clin Biochem，1998，31(5):335－340.

［2］Marx SO，Marks AR.Bench to bedside:the development of rapamycin and its application to stent restenosis ［J］.Circulation，2001，104(8):852－855.

［3］Flechner SM，Goldfarb D，Modlin C，et al.Kidney transplantation without calcineurin inhibitor drugs:a prospective，randomized trial of sirolimus versus cyclosporine ［J］.Transplantation，2002，74(8):1070－1076.

［4］Keogh A，Richardson M，Ruygrok P，et al.Sirolimus in de novo heart transplant recipients reduces acute rejection and prevents coronary artery disease at 2 years:a randomized clinical trial ［J］.Circulation，2004，110(17):2694－2700.

［5］Trotter JF，Wachs M，Bak T，et al.Liver transplantation using sirolimus and minimal corticosteroids(3－day taper)［J］.Liver Transpl，2001，7(4):343－351.

［6］Shitrit D，Rahamimov R，Gidon S，et al.Use of sirolimus and low－dose calcineurin inhibitor in lung transplant recipients with renal impairment:results of a controlled pilot study［J］.Kidney Int，2005，67(4):1471－1475.

［7］Guertin DA，Sabatini DM.An expanding role for mTOR in cancer ［J］.Trends Mol Med，2005，11(8):353－361.

［8］Fajadet J，Morice MC，Bode C，et al.Maintenance of longterm clinical benefit with sirolimus－eluting coronary stents:three－year results of the ravel trial［J］.Circulation，2005，111(8):1040－1044.

［9］Almalla M，Schr?der J，Deserno V，et al.Long－term clinical outcome of sirolimus－eluting stent implantation in metabolic syndrome and diabetes ［J］.J Invasive Cardiol，2010，22(7):317－321.

［10］Fernandez－Bussy S，Akindipe O，Baz M，et al.Sirolimusinduced severe hypertriglyceridemia in a lung transplant recipient［J］.Transplantation，2010，89(4):481－482.

［11］Morales JM，Hartmann A，Walker R，et al.Similar lipid profile but improved long－term outcomes with sirolimus after cyclosporine withdrawal compared to sirolimus with continuous cyclosporine ［J］.Transplant Proc，2009，41(6):2339－2344.

［12］劉蕾，周偉燕，孫春華，等.同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜法測定血清總膽固醇 ［J］.中華檢驗醫(yī)學雜志，2007，30(3):250－254.

［13］Morrisett JD，Ghada AF，Ron H，et al.Effects of sirolimus on plasma lipids，lipoprotein levels，and fatty acid metabolism in renal transplant patients［J］.J Lip Res，2002，43(8):1170－1180.

［14］Brown MS，Goldstein JL.The SREBP pathway:regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane－bound transcription factor ［J］.Cell，1997，89(5):331－340.

［15］Dugail I，Le Lay S，Varret M，et al.New insights into how adipocytes sense their triglyceride stores.Is cholesterol a signal［J］?Horm Metab Res，2003，35(4):204－210.

［16］Wu YY，Chiu YS，Chen WY，et al.Long－term administration of rapamycin reduces adiposity，but impairs glucose tolerance in high－fat diet－fed KK/HlJ mice ［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2009，105(3):188－198.

［17］Magun R，Gagnon A，Yaraghi Z，et al.Expression and regulation of neuronal apoptosis inhibitory protein during adipocyte differentiation ［J］.Diabetes，1998，47(12):1948－1952.

［18］Minokoshi Y，Shiuchi T，Lee S，et al.Role of hypothalamic AMP－kinase in food intake regulation ［J］.Nutrition，2008，24(9):786－790.

［19］Blümer RM，van Roomen CP，Meijer AJ，et al.Regulation of adiponectin secretion by insulin and amino acids in 3T3－L1 adipocytes［J］.Metabolism，2008，57(12):1655－1662.