石學(xué)剛

歐盟已經(jīng)禁止在家禽飼料中使用抗生素生長促進(jìn)劑(AGPs)，隨著對食品安全問題的關(guān)注，在美國，消費者也向政府施加壓力要求在動物飼料中禁止使用抗生素生長促進(jìn)劑。為了滿足市場需求，尋找動物飼料中抗生素生長促進(jìn)劑的替代物，從2004年開始，丹尼斯克便對不同的精油產(chǎn)品進(jìn)行體外試驗，以篩選出具有潛在的抗病原微生物作用；同時，有利于有益微生物的生長繁殖。其主要目的是為了開發(fā)出一種精油復(fù)合物，能夠促進(jìn)單胃動物生長，并有效控制病原微生物的繁殖。

精油是一種具有揮發(fā)性的芳香族化合物，它是由植物體合成，具有抗細(xì)菌、真菌和病毒的作用；同時也有阻止食草昆蟲及動物的采食。在草藥和香料中，它是一種重要的芳香類化合物，并在食物自然保存過程中起著極其重要的作用。因此，精油的抗菌作用被人們廣泛認(rèn)識(Kalemba等,2003)。

體外試驗研究表明，精油復(fù)合物的抗菌作用要顯著高于單個精油成分，表明不同精油在抗菌作用方面具有協(xié)調(diào)效應(yīng)(Burt,2004；Lee等,2004a)。例如經(jīng)過精心篩選出的兩種與天然成分一樣的精油復(fù)合物——百里香酚和肉桂醛，能夠有效維持健康的腸道微生物菌群、改善動物的生產(chǎn)性能。

精油的化學(xué)結(jié)構(gòu)及目標(biāo)菌群細(xì)胞膜的形態(tài)構(gòu)造都會影響精油的抗菌作用。精油由不同的化合物組成，具有不同結(jié)構(gòu)和化學(xué)特性。因此，精油的抗菌作用沒有一個特定的機(jī)理，而是作用于多種目標(biāo)細(xì)菌的細(xì)胞壁。

單萜苯酚如百里香酚和香芹酚，通過和氫結(jié)合與細(xì)胞膜相互作用，破壞細(xì)胞膜成分，使線粒體更具通透性，致使外部細(xì)胞膜破裂，抑制細(xì)菌生長，特別是對革蘭氏陰性菌作用顯著，如大腸桿菌O157：H7、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門氏菌、熒光假單胞菌、熱殺索絲菌(Di Pasqua等，2007)。

苯丙烷類物質(zhì)如肉桂醛，它能夠通過羰基基團(tuán)與蛋白質(zhì)結(jié)合，阻止細(xì)胞酶的作用，如脫羧酶(Wendakoon 等,1995；cited by Burt,2004)。肉桂醛對產(chǎn)氣莢膜梭菌[革蘭氏(+)]和脆弱類桿菌[革蘭氏(-)]具有顯著的抑制作用，但對雙歧桿菌和嗜熱乳桿菌的抑制作用很弱(Lee 等,1998)。

精油所處基質(zhì)的pH值能夠影響精油的疏水性，從而影響它與細(xì)菌細(xì)胞膜之間的相互作用，因此，會影響精油在動物腸道不同部位的抗菌作用。Michiels等(2009)在體外模擬豬腸道環(huán)境進(jìn)行試驗，結(jié)果表明，百里香酚和香芹酚在胃中抑制乳酸桿菌的作用要遠(yuǎn)高于小腸。百里香酚有效抑制前腸道乳酸桿菌，降低動物發(fā)生酸中毒的危險。而肉桂醛對后腸道乳酸桿菌的促進(jìn)作用對動物有益。pH值對精油生物活性的作用，以及精油對有害微生物生長繁殖的影響使精油成為動物腸道微生物調(diào)節(jié)物的理想選擇。

1 百里香酚和肉桂醛的抗菌作用

在體外厭氧環(huán)境下，在不同細(xì)菌的純培養(yǎng)基中增加精油含量，觀察不同濃度精油的抑菌效果(Ouwehand等，2010)。通過對產(chǎn)氣莢膜梭菌的測定，結(jié)果表明產(chǎn)氣莢膜梭菌受香芹酚、肉桂醛、檸檬醛、檸檬油精和百里香酚的抑制作用，特別是在高濃度時抑制作用更明顯（500mg/l)；同時牛至油、迷迭香油及百里香油也具有抑菌作用。對鏈球菌的敏感性測定結(jié)果表明，精油主要是在高濃度時具有抑菌作用。測定沙門氏菌血清型結(jié)果表明，該菌只在精油高濃度下敏感（500mg/l)；大腸桿菌對大部分精油敏感，即使在低濃度下也敏感（5和50mg/l)；長雙歧桿菌、短雙歧桿菌和羅伊氏乳桿菌對大部分精油缺乏敏感性，而在較低濃度精油含量下，雙歧桿菌乳酸亞種和發(fā)酵乳酸桿菌對精油具有相對敏感性（5和50mg/l)，盡管精油對細(xì)菌生長的抑制作用低于抗生素類促生長劑阿維霉素，除沙門氏菌和大腸桿菌外，所有的測試微生物均對阿維霉素敏感。該結(jié)果表明，精油在抑菌方面比抗生素類促生長劑（AGPs）更具有選擇性。最初的純培養(yǎng)基培養(yǎng)及單個的精油測試結(jié)果表明，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物更具抑菌的潛能。通過后來的測定發(fā)現(xiàn)，這種混合物能夠抑制至少50%的革蘭氏陰性細(xì)菌生長（見圖1）。特別是對革蘭氏陰性菌種，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物對大腸桿菌和沙門氏菌屬的作用效果更顯著。精油對革蘭氏陽性菌的作用效果不明顯。

圖1 與未處理相比，在體外純培養(yǎng)基中添加百里香酚和肉桂醛復(fù)合物或阿維霉素對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌生長抑制作用

在厭氧條件下，進(jìn)一步測定精油在純培養(yǎng)基中對不同血清型和不同種沙門氏菌的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物能夠顯著降低沙門氏菌生長，甚至完全抑制了沙門氏菌的生長（見圖2）。

圖2 百里香酚和肉桂醛復(fù)合物對沙門氏菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外生長抑制作用

精油不僅對病原微生物起作用，而且對寄生蟲也有作用。研究表明，精油對艾美爾球蟲有作用。Remmal(2011)等體外試驗研究表明，在精油濃度低于0.5mg/ml時，特別是蒿、丁香、茶樹及百里香草對艾美爾球蟲蟲卵具有致死作用，添加這些精油會殺死一部分蟲卵。在殺蟲方面，百里香草中最主要的精油成分是百里香酚。同樣也測定了肉桂（主要成分是肉桂醛），但發(fā)現(xiàn)它的致死性較低，LC50值低于4mg/ml。

研究表明，百里香酚對霉菌和酵母具有抑制作用，而肉桂醛的作用效果更好。當(dāng)測定與真菌有關(guān)的腐爛時，百里香酚和肉桂醛具有良好的抗真菌作用（見表1）。我們的研究結(jié)果與其它報道中有關(guān)純精油的抗真菌作用一致(Cheng等,2008；Hsu等,2007；Segvi Klari等,2007；Lopez 等,2007；Tullio 等,2007)。在我們的試驗中，所有的真菌菌株對測定的精油均敏感,特別是肉桂醛表現(xiàn)出最小抑菌濃度(MICs)，通常最小抑菌濃度低于0.10mg/ml，抑制霉菌和酵母的平均最小抑菌濃度為0.039mg/ml。百里香酚抑制微生物的平均濃度為0.249mg/ml。

表1 百里香酚(99%)和反式肉桂醛(98%)對真菌目標(biāo)株的最小抑菌濃度(MICs)(mg/ml)

2 飼料中百里香酚和肉桂醛的穩(wěn)定性(見圖3、圖4)

圖3 在22℃和35℃條件下肉桂醛在飼料中經(jīng)過2、3和6個月的貯存穩(wěn)定性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，N=7)

包被精油可以降低有效成分的揮發(fā)，增加產(chǎn)品在飼料中的穩(wěn)定性。研究由麥芽糊精包裹的具有揮發(fā)性的百里香酚和肉桂醛的微膠囊顆粒的穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，百里香酚和肉桂醛的添加濃度分別為5mg/kg和15mg/kg時，飼料貯存在22℃和35℃兩個溫度條件下，在試驗開始及2、3和6個月時用氣相色譜法分析百里香酚和肉桂醛的濃度。如果復(fù)合物的穩(wěn)定性用初始濃度的百分比表示，經(jīng)過6個月貯存試驗，百里香酚和肉桂醛的回收率在每次測定中均高于93%。

圖4 在22℃和35℃條件下百里香酚在飼料中經(jīng)過2、3和6個月的貯存穩(wěn)定性（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，N=7）

3 百里香酚和肉桂醛的殺蟲特性

小麥基礎(chǔ)飼料在庫房貯存過程中會遭受病蟲害的侵害，這對于原料保存來說是一個比較嚴(yán)峻問題，特別是在炎熱和潮濕地區(qū)這種危害更大。已經(jīng)有報道，粉碎的小麥基礎(chǔ)原料在庫房中貯存會受到昆蟲的危害。這些昆蟲包括赤擬谷盜(rust-red flour beetle)、雜擬谷盜 (confused flour beetle)和谷蠹 (rust-red grain beetle)，它們會部分或全部在產(chǎn)品中生長繁殖，在熱帶和溫帶地區(qū)谷物和谷物產(chǎn)品中均發(fā)現(xiàn)此類害蟲。此類害蟲一旦存在，將會持續(xù)損害谷物產(chǎn)品，因此，應(yīng)該首先考慮采取預(yù)防措施。為了防止真菌污染，谷物產(chǎn)品被封裝在多層紙袋中，只允許谷物與外界環(huán)境“透氣”。然而，此方法并不能防止害蟲對谷物產(chǎn)品的危害。

一項試驗研究了以小麥為載體的酶(ENZ)受兩種擬谷盜害蟲危害時，補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛復(fù)合物，用來評估對害蟲成蟲殺蟲效果和第一代害蟲生長抑制（F1）。在處理后84 d，添加精油復(fù)合物組和小麥為載體的酶及精油復(fù)合物合并添加組(ENZ+精油復(fù)合物；1：1，1：2)中鋸谷盜的成蟲全部死亡 (見圖 5)。在所有混合添加組中F1代都沒有生長，這表明添加后完全抑制了害蟲的生長發(fā)育。在整個試驗期內(nèi)，精油復(fù)合物組赤擬谷盜的成蟲死亡率接近100%，然而，小麥為載體的酶+精油復(fù)合物組（1：2）隨著試驗的進(jìn)行，成蟲死亡率從85%降低到70%，小麥為載體的酶+精油復(fù)合物組（1：1）從68%降低到50%（見圖6）。只有在84 d時，在小麥為載體的酶+精油復(fù)合物（1：1）組中發(fā)現(xiàn)了赤擬谷盜的F1代。

精油另一項試驗研究了在選擇或不選擇可替代谷物精油時的抗病蟲害作用，在84 d的試驗期內(nèi)，與對照組相比，添加精油復(fù)合物處理組能夠使害蟲鋸谷盜的比例降低(P＜0.05)。在試驗期內(nèi)，與加小麥為載體的酶組相比，添加精油復(fù)合物能夠使雜擬谷盜的比例降低(P＜0.05)。

研究結(jié)果表明，在添加小麥為載體的酶基礎(chǔ)上補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛復(fù)合物能夠?qū)煞N擬谷盜起到防蟲和驅(qū)蟲效果。在混合谷物中添加精油復(fù)合物，能夠?qū)M谷盜起到殺蟲和驅(qū)蟲的作用。在混合谷物中添加牛至油能夠?qū)认蠛碗s擬谷盜起到殺蟲效果，添加后二者的成蟲死亡率分別為68%和37%(Kordali等,2008)。另一項試驗研究了混合谷物中添加百里香酚和甲基胡椒酚對谷象、米象和綠豆象害蟲的防治作用，結(jié)果顯示，添加后能夠起到防蟲和驅(qū)蟲作用(Ojimelukwe等，2002)。

圖5 飼糧添加小麥為載體的酶（ENZ）、百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物（精油復(fù)合物）及小麥為載體的酶+百里香酚和肉桂醛復(fù)合物（ENZ+精油復(fù)合物；1： 1、1： 2）對鋸谷盜成蟲死亡率的影響

圖6 飼糧添加小麥為載體的酶（ENZ）、百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物（精油復(fù)合物）及小麥為載體的酶+百里香酚和肉桂醛復(fù)合物（ENZ+精油復(fù)合物；1：1、1：2）對赤擬谷盜成蟲死亡率的影響

4 百里香酚和肉桂醛對腸道微生物及代謝的調(diào)節(jié)作用

上述體外試驗結(jié)果表明，添加精油復(fù)合物百里香酚和肉桂醛具有抗菌特性，可用于抗病菌。在飼料中添加特殊的精油復(fù)合物，在肉雞試驗中同樣具有抗菌作用。研究結(jié)果表明，百里香酚和肉桂醛二者在促進(jìn)肉雞腸道健康方面具有協(xié)同作用。在飼喂不添加酶制劑的小麥基礎(chǔ)飼糧中，補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛的復(fù)合物對肉雞腸道病原菌具有抑制作用，特別是對大腸桿菌作用更明顯，但對腸道有益微生物沒有影響(Tiihonen等，2010)。腸道有益微生物菌群的改善與動物的生產(chǎn)性能有關(guān)，然而，腸道總菌群組成的改善是由于百里香酚和肉桂醛對特定菌群的作用，從而使全腸道微生物種群向有益菌轉(zhuǎn)移所致 (Tiihonen等，2010)；第二個肉雞試驗同樣表明，添加精油對腸道產(chǎn)氣莢膜梭菌具有抑制作用，同時能夠增加乳酸菌和雙歧桿菌的生長(Nurminen等，2010)。試驗3表明，添加百里香酚和肉桂醛能夠降低41日齡肉雞盲腸產(chǎn)氣莢膜梭菌（見圖7）。

圖7 在三個肉雞試驗中，與對照組相比，添加精油復(fù)合物（百里香酚和肉桂醛）能夠使肉雞盲腸食糜中的產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)降低（對數(shù)）

不僅腸道菌群對肉仔雞營養(yǎng)狀況和腸道健康有作用，微生物的代謝產(chǎn)物對其也有作用。研究已經(jīng)證明，腸道微生物的活性與短鏈脂肪酸 (SCFA)、支鏈脂肪酸(BCFA)和生物胺的濃度有關(guān)。來自碳水化合物(如SCFAs)或蛋白質(zhì)(如BCFAs、生物胺)的微生物發(fā)酵產(chǎn)物能夠反映營養(yǎng)物質(zhì)在動物腸道消化和發(fā)酵的過程。在Gleadthorpe(UK)ADAS進(jìn)行的一項試驗研究了在肉雞豆粕-小麥型基礎(chǔ)飼糧中添加百里香酚和肉桂醛復(fù)合物對腸道微生物的影響 (Tiihonen等,2010)。飼料添加精油復(fù)合物能夠增加盲腸中丁酸的比例，丁酸被公認(rèn)為可以為結(jié)腸黏膜提供能量(Roediger，1980)，對小腸健康具有潛在作用 (Cheppach等，2001；Hamer等，2008)。此外，精油處理組降低了乙酸、異戊酸和酪胺的比例，但盲腸胺比例增加。支鏈脂肪酸和生物胺在胃腸道的生理作用目前尚不完全清楚。Sousadias等(1995)報道，飼喂低濃度生物胺飼糧能夠增加肉雞增重、改善飼料效率。以上試驗結(jié)果可以為精油在肉雞飼糧中的使用提供理論參考，添加精油的目的是為了改善腸道微生物組成和活性，從而改善肉雞的生產(chǎn)性能和健康。

5 百里香酚和肉桂醛的促生長作用

精油具有芳香氣味，能夠刺激動物食欲，因此它對幼齡動物的健康生長特別重要。有幾項關(guān)于精油能夠刺激動物食欲的假設(shè)，即精油的特殊氣味、飼料消化率的改善及由于腸道菌群的改善而使后腸道一些未消化的纖維顆粒的發(fā)酵程度提高。

研究結(jié)果表明，在不添加酶制劑或抗球蟲劑的肉雞小麥基礎(chǔ)飼糧中，補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛能夠增加42日齡肉雞的體增重、降低死亡率(Tiihonen等,2010)。該試驗中，生產(chǎn)性能的改善很可能和添加精油后肉雞采食量提高和腸道健康改善有關(guān)(Tiihonen等,2010)。Nurminen等（2010）進(jìn)行的一項試驗表明，在小麥基礎(chǔ)飼糧中補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛能夠顯著改善肉雞的生產(chǎn)性能，同時能夠改善盲腸微生物菌群(Salam 等，2002；Lee 等，2003、2004a、2004b；Jamroz等,2005)。另一試驗中,在肉雞飼糧中添加外源酶制劑（植酸酶和木聚糖酶）、百里香酚和肉桂醛，能夠有效改善前期和全期（42日齡）肉雞采食量和體增重(Peron等,2009)；在一項1 000只羅斯肉雞的半商業(yè)試驗中，在含有抗球蟲劑的前期和生長期飼糧中補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛組與對照組相比，能夠使0～31日齡肉雞的體增重提高5%(Bento等,2008)。同樣有研究表明，在不添加抗球蟲劑的肉雞后期飼糧中補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛能夠使肉雞體增重提高11%。這表明在不添加抗球蟲劑的應(yīng)激階段，補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛可以改善肉雞的生產(chǎn)性能。這些結(jié)果表明，在不添加抗球蟲劑階段，補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛能夠維持肉雞腸道健康，同時改善肉雞的生產(chǎn)性能。

對16個肉雞試驗采用薈萃分析 (Amerah等,2010)，結(jié)果表明，肉雞飼糧添加精油能夠顯著改善日采食量，使肉雞日增重和飼料轉(zhuǎn)化率得到改善。該模型還表明，補(bǔ)充添加木聚糖酶可以使精油的作用效果進(jìn)一步增加。精油對腸道微生物的調(diào)節(jié)與肉雞健康和免疫有關(guān)，因此能夠改善肉雞生產(chǎn)性能和福利。三項研究結(jié)果表明，在肉雞飼糧中添加精油能夠改善墊料質(zhì)量和糞便評分、降低肉雞死亡率。芳香植物精油對斷奶母豬也有顯著的效果，添加牛至油能降低母豬死亡率，改善母豬繁殖性能，使母豬窩產(chǎn)活仔數(shù)增加(Mauch 等，2004)。

幾項研究結(jié)果表明，無論添加還是不添加酶制劑，添加精油都能有效地改善營養(yǎng)物質(zhì)的消化率。在進(jìn)行的兩項肉雞試驗結(jié)果表明，肉雞玉米(Cao等，2009)或小麥(Amerah等，2010)基礎(chǔ)飼糧中無論是否添加外源酶制劑，添加百里香酚和肉桂醛對營養(yǎng)物質(zhì)消化率都具有正效應(yīng)。精油復(fù)合物對肉雞前期的作用效果更顯著。

肉雞試驗結(jié)果表明，飼糧添加有機(jī)酸和精油對肉雞胴體性能沒有影響，如屠宰率和胸肉產(chǎn)量(Zhang等,2005)。這與我們對百里香酚和肉桂醛的研究結(jié)果一致。肉雞飼糧添加百里香酚和肉桂醛對屠宰率、胸肉產(chǎn)量或胸肉感官特性沒有影響(Schulze等,2008)。

總之,在無抗生素飼糧中補(bǔ)充添加百里香酚和肉桂醛能夠有效改善肉雞的生產(chǎn)性能、腸道微生物菌群及動物福利。結(jié)果表明，精油是抗生素生長促進(jìn)劑的有效替代物。

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