朱曉紅 王曉梅 張艷萍 王 毅 馬 旭

國家人口計生委科學技術研究所(北京，100081)

Y染色體無精子因子(AZF)微缺失是導致生精障礙的主要遺傳學原因之一［1］，常見于不育癥患者［2］。Y染色體微缺失篩查有預測價值并可影響臨床治療措施的選擇，因此目前臨床分子遺傳學科室已逐步開展染色體微缺失檢測工作。檢測基因缺失最常見的方法為聚合酶鏈反應(PCR)擴增技術，對于目的位點擴增結果呈陰性的樣品除重復檢測以外，一般還需要用Southern雜交進行確認。因而基于多重PCR的技術僅僅可以作為基因缺失的篩查技術，而篩查還需要考慮操作的簡便性和篩查成本。為此，本研究比較了進口20個序列標簽位點(STS)與國產(chǎn)15個STSY染色體AZF 微缺失篩查試劑的穩(wěn)定性、重復性和有效性，為臨床分子遺傳實驗室開展相關工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對象

46例無精(43例)、少精癥(3例)患者來自國家人口計生委科學技術研究所門診，所有患者均結婚2年以上。精液分析及無精癥、少精癥診斷按世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦方法和診斷標準［3］進行，即連續(xù)2次精液檢查分析并經(jīng)離心沉淀均無精子者為無精癥，精子密度＜5×106/ml者為少精癥。另外選擇2例已正常生育的男性為對照，2例正常生育女性為陰性對照，純水作為空白對照。

1.2 Y染色體AZF微缺失檢測

1.2.1 DNA提取采集外周血3ml，EDTA抗凝。按照血液基因組DNA提取試劑盒(購自北京天根生化科技公司)說明進行DNA提取，－20℃保存。

1.2.2 20個STSAZF微缺失檢測Y染色體微缺失檢測試劑盒購自美國PROMEGA公司(Ca#MD1531 Lot#290463)，根據(jù)歐洲男科協(xié)會(EAA)和歐洲分子遺傳實驗預控網(wǎng)(EMQN)檢測指南推薦的方法，應用多重PCR技術進行檢測。擴增體系采用位于Y染色體的SMCX基因和ZFX/ZFY基因為PCR擴增內對照。20個STS在Y染色體上的位置和擴增體系組合見表1。反應條件為:基因組DNA 2μl，引物混合液20μl，金牌 Taq 酶 0.5μl，純水 2.5μl，體系為 25μl。擴增條件為:94℃ 2min，94℃ 1min，57℃ 30s，72℃1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物8μl加2μl 6×上樣緩沖液，充分混合均勻后經(jīng)4.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120V)40min，用培清 JS－680B全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)進行DNA電泳條帶觀察。

表1 Y染色體微缺失檢測20個STS的遺傳和多重PCR分組信息

1.2.3 15個STSAZF微缺失檢測Y染色體微缺失檢測試劑盒購自深圳亞能公司(20110401)，根據(jù)EMQN檢測指南推薦的方法采用多重PCR技術進行檢測。擴增體系采用位于Y染色體的ZFX/ZFY基因為PCR擴增內對照。15個STS的遺傳和多重PCR分組見表2。反應條件為:基因組 DNA 2μl，純水9μl，引物混合液 9μl，體系為 20μl。擴增條件為:95℃ 3min，95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，35 個循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物8μl加2μl 6×上樣緩沖液，充分混合均勻后經(jīng)4.0%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120V)40min，用培清JS－680B全自動凝膠成像分析系統(tǒng)進行DNA電泳條帶的觀察。

表2 Y染色體微缺失檢測15個STS的遺傳和多重PCR分組信息

2 結果

2.1 Y染色體AZF缺失檢測

46例無精、少精患者中共發(fā)現(xiàn)Y染色體AZF微缺失9例，均為無精癥患者，總缺失率為19.57%(9/46)。AZFa、AZFb、AZFc和 AZFd四個區(qū)域的缺失構成比分別是 22.22%、37.5%、88.89% 和 88.89%。其中，AZFa單獨缺失1例、AZFc+d聯(lián)合缺失5例、AZFb+c+d聯(lián)合缺失2例，AZFa+b+c+d 1例。

圖1 無精癥和少精癥患者AZF缺失電泳圖舉例

2.2 商品化試劑的評價

2.2.1 20STS和15STS檢測試劑敏感性比較20STS復合擴增體系的推薦DNA用量為50ng/PCR反應，即5個復合擴增體系的DNA用量為250ng;15STS推薦DNA用量為200～400ng/PCR反應，4個復合擴增體系的DNA用量為800ng。在實際檢測過程中，20STS與15 STS均使用相同的DNA用量，即2μl/反應，約為100ng/反應，如圖1所示泳道1～4、6～9是20STS擴增產(chǎn)物，泳道11～14是15STS擴增產(chǎn)物，上述DNA用量均滿足兩者擴增反應的要求，15STS擴增系統(tǒng)具有略高的敏感度。

圖2 20STS和15STS檢測靈敏度對比

2.2.2 20STS和15STS檢測試劑的穩(wěn)定性比較

20STS復合擴增體系的推薦使用時間是2年，15STS推薦使用時間為6個月，保存條件均為－20℃。在本次檢測過程中，20STS與15STS均在有效期，陽性對照品擴增結果良好。20STS試劑在本實驗室包藏期超過1年，大于15STS檢測試劑的推薦有效期。

2.2.3 20STS與15STS檢測結果的一致性比較

46例無精、少精癥患者中，45例行Y染色體AZF微缺失檢測20STS與15STS結果一致。在YD－9個體中，AZFd區(qū)域SY145位點20STS未檢測到缺失而15STS檢測到缺失，但在AZFd區(qū)域的SY152位點20STS和15STS均檢測到缺失。

3 討論

Y染色體長臂AZF微缺失被認為是引起男性生精障礙的常見的遺傳病因。微缺失的發(fā)生是大的重復序列同源重組造成［4］，因此細胞遺傳學和Y染色體AZF微缺失分析對輔助生育具有指導意義。目前，部分研究或臨床采用6STS進行Y染色體長臂AZF微缺失的檢測［5］，獲得AZF微缺失的頻率較低。采用數(shù)目較少的檢測體系可能減少基因缺失者的檢出，故建議選擇多基因座系統(tǒng)檢測試劑完成Y染色體AZF微缺失篩查工作。

本文系統(tǒng)比較了20STS和15STS的檢測結果，46例無精、少精癥患者中有45例行Y染色體AZF微缺失檢測20STS與15STS結果一致。在YD－9個體中，AZFd區(qū)域SY145位點20STS未檢測到缺失而15STS檢測到缺失，但同在AZFd區(qū)域的SY152位點檢測到缺失，故考慮結果判定一致。推測造成此現(xiàn)象的原因可能由于20STS與15STS中SY145基因座所選擇的引物位置不同，兩者的產(chǎn)物長度一個為143bp，另一產(chǎn)物長140bp。由于個體在引物結合區(qū)的微小變異可能造成擴增產(chǎn)物的丟失，而非實際DNA序列的缺失，故不同的擴增試劑可能造成Y缺失檢測時個別基因座的假陰性或假陽性。

本研究嚴格依照EMQN檢測指南中闡述的質量控制完成實驗，研究結果表明國產(chǎn)試劑與進口試劑具有相同的檢測穩(wěn)定性、重復性和有效性，故考慮國產(chǎn)試劑具有較高的性價比。

1 李座祥，王琳，唐文豪，等.Y染色體無精子癥因子區(qū)及男性不育相關基因研究進展［J］.生殖醫(yī)學雜志，2005，14(3):176－81.

2 Simoni M，Bakker E，Krausz C，et al.EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y － chromosomal microdeletions.State of the art 2004［J］.International Journal of Andrology，2004，27:240－249.

3 World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination human semen and sperm －cervical mucus interaction［M］.5th ed.London:London Cambridge University Press，2009:4－33.

4 Ferlin A，Moro E，Rossi A，et al.The human Y chromosome’s azoospermia factor b(AZFb)region:sequence，structure，and deletion analysis in infertile men［J］.J Med Genet，2003，40(1):18 －24.

5 Mitra A，Dada R，Kumar R，et al.Screening for Y－chromosome micro－deletions infertile Indian males:Utility of simplified multiplex PCR［J］.Indian J Med Res，2008，127(2):124 －132.