鐘澤艷 萬(wàn)均輝 田佩玲 韋相才* 張清健 李銘臻 黃立英 鄧文國(guó)

1.南方醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳教研室(廣州，510515);2.廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所;3.中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心

唐氏綜合征(又稱21-三體綜合征或先天愚型)屬常染色體疾病，是最常見(jiàn)的一種嚴(yán)重的先天性智力發(fā)育不全性遺傳疾病。在新生兒中的發(fā)生率為1/600～1/800，全國(guó)每年大約有2.6萬(wàn)唐氏綜合征患兒出生，給患兒家庭及社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)［1］。該病目前還缺乏有效的治療手段，通過(guò)產(chǎn)前篩查或產(chǎn)前診斷預(yù)防唐氏綜合征患兒出生是防治該病的重要措施。目前臨床上采用的篩查方法是孕婦血清標(biāo)志物非特異性篩查，特異度低，假陽(yáng)性率高;而傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法則需取羊水標(biāo)本，創(chuàng)傷較大，且程序繁瑣，檢驗(yàn)周期長(zhǎng)。因此，如何建立快速有效、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，易于推廣的診斷方法是研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，唐氏綜合征產(chǎn)前診斷在取材方式、遺傳標(biāo)記的選擇和分子生物學(xué)檢測(cè)方法方面取得廣泛的進(jìn)展。本文選擇21號(hào)染色體雜合度較高的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位標(biāo)，通過(guò)應(yīng)用多重?zé)晒舛烤酆厦告湻磻?yīng)(QF-PCR)，對(duì)106例正常人外周血DNA進(jìn)行分析，結(jié)果用遺傳數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算出21號(hào)染色體的3個(gè)STR位標(biāo)的多態(tài)性信息含量(PIC)，并用該方法對(duì)25例唐氏綜合征患兒外周血和10例孕婦羊水進(jìn)行分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象106例無(wú)親緣關(guān)系個(gè)體的外周抗凝靜脈血來(lái)自本所優(yōu)生遺傳門診，外周抗凝靜脈血采集于廣州智靈學(xué)校，羊水標(biāo)本由中山大學(xué)達(dá)安基因診斷中心提供。

1.1.2儀器和試劑主要儀器有DNA熱循環(huán)儀、ABI3100遺傳分析儀、凝膠電泳圖像系統(tǒng)。主要試劑有Taq DNA酶、dNTP(上海博亞生物工程公司產(chǎn)品);溴化十六烷三甲基胺(CTAB)及溴化十二烷三甲基胺(DTAB)(美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品);毛細(xì)管電泳試劑(美國(guó) ABI公司產(chǎn)品);FAM、VIC標(biāo)記D21S1411、D21S1412、DS21S1270(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成和純化)。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取外周靜脈血2ml，利用CTAB、DTAB快速提取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的外周血DNA，羊水DNA由改進(jìn)的傳統(tǒng)方法提取。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查取，3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均為四核苷酸重復(fù)序列，在21號(hào)染色體上的位置分別是:D21S1411位于21q22.3，D21S1412位于21q22.2，D21S1270位于21q22.1，根據(jù)其基本情況設(shè)計(jì)引物，在引物的5’端標(biāo)記熒光，見(jiàn)表1。

1.2.3 QF-PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積25μl，擴(kuò)增體系包含:10 ×Gold PCR Buffer、Taq DNA polymerase(5U/μl，上海生工生物工程公司)、dNTPs(10mM)、cDNA(50～100ng)、Primer mix(FAM、VIC 標(biāo)記)和超純水。反應(yīng)條件:94℃熱啟動(dòng)5min，94℃變性30s，56℃退火1min，72℃ 延伸 1min，28 個(gè)循環(huán)，最后 72℃ 延伸10min，4℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物結(jié)果分析采用瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物純度，通過(guò)ABI 3100遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，收集軟件(Collection)收集電泳信息，基因掃描軟件(GeneScan3.7)分析擴(kuò)增片段大小和基因型分析模板(Genotyper 2.1)檢測(cè)各位點(diǎn)的基因型。

1.2.5 細(xì)胞核型分析常規(guī)方法進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞無(wú)菌培養(yǎng)，定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和染色體制備。采用原位法進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)，染色體核型制備，染色體G顯帶方法進(jìn)行染色體核型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果以±s表示，進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。通過(guò)Power StatsV12 Software進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算3個(gè)STR基因座的觀察雜合度(Ho)、個(gè)體識(shí)別率(DP)、非父排除(PE)、多態(tài)信息量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 STR位點(diǎn)分析結(jié)果

106例正常無(wú)親緣關(guān)系標(biāo)本的外周血DNA，通過(guò)QF-PCR分析21號(hào)染色體上的3個(gè)STR:D21S1411、D21S1412、D21S1270 的 PIC 分 別 為0.913、0.835、0.856，確立了 QF-PCR 產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的方法。產(chǎn)物經(jīng)ABI 3100遺傳分析儀分析，分析所得數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)3個(gè)STR位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，是一組理想的遺傳標(biāo)記。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢，可得D21S1411的染色體位置為44160692:44160948(bp)，D21S1412的染色體位置為40750293(bp)，D21S1270的染色體位置為31706781:31706930(bp)，通過(guò)計(jì)算繪制物理比例距離見(jiàn)圖1。

表2 106例外周血DNA的21號(hào)染色體特異STR位標(biāo)的遺傳分析結(jié)果

圖1 21號(hào)染色體特異的STR位標(biāo)染色體定位距離

2.2 核型分析結(jié)果

QF-PCR方法對(duì)25例唐氏綜合征患兒外周血和10例正常孕婦羊水(其中2例血清篩查陽(yáng)性)DNA樣本的3個(gè)位標(biāo)擴(kuò)增分析結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)10例正常孕婦羊水中2例血清生化指標(biāo)篩查陽(yáng)性者通過(guò)該方法分析，檢測(cè)到2例唐氏綜合征患兒。所有25例標(biāo)本均經(jīng)核型分析確證，QF-PCR診斷結(jié)果與染色體核型分析結(jié)果一致。結(jié)果判定:21號(hào)染色體上的任意遺傳位點(diǎn)出現(xiàn)3個(gè)等位基因熒光峰，峰值面積比值為1∶1∶1時(shí)，或者21號(hào)染色體上的任意遺傳位點(diǎn)出現(xiàn)兩個(gè)等位基因熒光峰，峰值面積比為2∶1或1∶2或出現(xiàn)峰值面積未達(dá)到2∶1/1∶2，但＜0.65或者＞1.8時(shí)，預(yù)測(cè)患有唐氏綜合征。AMX與AMY面積比值接近1∶1提示該胎兒為男性。其中1例唐氏綜合征男性胎兒陽(yáng)性樣本的基因掃描圖像見(jiàn)圖2，經(jīng)染色體核型分析結(jié)果為:47，XY，+21，核型圖見(jiàn)圖4;1例陰性樣本的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，經(jīng)染色體核型分析結(jié)果為:46，XY，核型圖見(jiàn)圖5。兩種方法診斷結(jié)果一致。

表3 27例唐氏綜合征患兒外周血和羊水DNA STR位標(biāo)擴(kuò)增分析結(jié)果

3 討論

迄今為止，醫(yī)學(xué)上對(duì)唐氏綜合征尚無(wú)有效的預(yù)防和治療措施，唯一可以采取的手段就是進(jìn)行產(chǎn)前和移植前遺傳學(xué)診斷，以決定是否放棄胚胎移植或終止妊娠［2］，臨床主要采用常規(guī)染色體核型分析技術(shù)進(jìn)行診斷，但該法所需周期長(zhǎng)、繁瑣，專業(yè)技術(shù)要求高，尤其在產(chǎn)前診斷中由于羊水、臍血細(xì)胞不易培養(yǎng)，不便于大規(guī)模的產(chǎn)前普查，另外長(zhǎng)周期等待診斷結(jié)果給孕婦造成巨大的心理負(fù)擔(dān)，有導(dǎo)致流產(chǎn)的可能［3］。20世紀(jì)90年代初，Mansfield等應(yīng)用定量熒光PCR擴(kuò)增STR進(jìn)行非整倍體快速檢測(cè)，現(xiàn)該方法在國(guó)外已得到廣泛應(yīng)用［4，5］，被多個(gè)實(shí)驗(yàn)室確認(rèn)為快速診斷染色體非整倍體畸變的可靠方法［6，7］。目前國(guó)內(nèi)也有很多相關(guān)研究［8～11］，證明了該法快速診斷染色體非整倍體的可行性。此外還有生物素標(biāo)記的多重PCR、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，及引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記技術(shù)(PRINS)和熒光定量等方法，而主要篩查方法有血清學(xué)三聯(lián)試驗(yàn)(AFP、β-HCG、uE2)，PAPPA、inhibin-A標(biāo)記，B超檢查等，以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)［1］。

STR是單位長(zhǎng)度為2～6bp的重復(fù)序列，被稱為人類第二類遺傳標(biāo)記，其在人類基因組中分布廣泛、均勻，有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，人群中雜合度高、能提供較高信息含量，是定量檢測(cè)人類染色體數(shù)目異常最有力的遺傳標(biāo)記，目前應(yīng)用非常廣泛［11，12］。相對(duì)于正常人，患者的體細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)染色體數(shù)目增加或減少，因此染色體上相應(yīng)的STR位點(diǎn)的量也會(huì)隨之增加或減少，通過(guò)對(duì)這些STR位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，用銀染或者熒光標(biāo)記的方法即可根據(jù)PCR產(chǎn)物的量推斷染色體量的改變。

本研究對(duì)廣東地區(qū)人群21號(hào)染色體特異的3個(gè)STR位點(diǎn)遺傳多態(tài)性的研究結(jié)果，結(jié)合已發(fā)表的廣東地區(qū)STR資料進(jìn)行群體遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)廣東人群3個(gè)STR位點(diǎn)基因型頻率分布符合Hardy—Weinberg平衡定律。一個(gè)STR基因座的Ho應(yīng)至少在0.7以上才能滿足作為鑒定標(biāo)志的要求。本研究選擇21號(hào)染色體的三個(gè) STR位點(diǎn) D21S1411、D21S1412及D21S1270作為擴(kuò)增靶點(diǎn)，其 Ho分別0.93、0.80、0.86。表明這3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中有較好的多態(tài)性，這對(duì)連鎖分析、基因診斷和個(gè)體鑒別等都有很重要的意義。通過(guò)這3個(gè)STR位點(diǎn)在染色體的定位以及物理距離的計(jì)算，可知均位于唐氏綜合征診斷特定關(guān)鍵區(qū)(21q22.1～21q22.3)內(nèi)，因而該法不僅可以診斷游離型21-三體，還可用于易位型21-三體的診斷。通過(guò)QF-PCR方法結(jié)合毛細(xì)管電泳進(jìn)行擴(kuò)增以及遺傳分析，對(duì)所選擇的STR位點(diǎn)在不同人群中的遺傳學(xué)指標(biāo)的計(jì)算，結(jié)果顯示這些STR位點(diǎn)具有高度的PIC和Ho。

本研究中采用的QF-PCR方法，在同一反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增多條目的片段，一次性通過(guò)毛細(xì)管電泳激光掃描，大大地提高診斷的時(shí)效性并減少了誤差。所采用QF-PCR對(duì)唐氏綜合征進(jìn)行產(chǎn)前診斷具有明顯的優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速，節(jié)省時(shí)間。其次，所需細(xì)胞數(shù)量少，敏感性高，外周血、絨毛、羊水、單細(xì)胞均可檢測(cè)［13］。對(duì)25例唐氏綜合征患兒外周血和2例血清篩查陽(yáng)性孕婦羊水DNA進(jìn)行診斷，與染色體核型分析一致，驗(yàn)證了該方法的可行性、準(zhǔn)確性。QF-PCR與傳統(tǒng)的染色體核型分析方法相比:無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，避免了培養(yǎng)過(guò)程中污染事件的發(fā)生;所需樣本量少;操作過(guò)程自動(dòng)化，減少人為因素的干擾;檢測(cè)周期短，只需1～2d就可以出結(jié)果，檢測(cè)時(shí)間縮短可減少孕婦因心理壓力增加導(dǎo)致的流產(chǎn)事件發(fā)生;所需費(fèi)用低。并且QF-PCR在敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，以及可重復(fù)性等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行分析，因此QF-PCR更適于大規(guī)模檢測(cè)。

綜上所述，QF-PCR具有無(wú)創(chuàng)傷、簡(jiǎn)單、快速、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，是較為理想的快速篩查唐氏綜合征的產(chǎn)前診斷技術(shù)。該技術(shù)的應(yīng)用有望提高唐氏綜合征的篩查確診率，彌補(bǔ)既往技術(shù)的不足，具有較好的實(shí)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。但是，對(duì)于易位型和嵌合型染色體三體的診斷可能出現(xiàn)漏診，并且當(dāng)異常核型細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確判斷［14］，因此還不能完全替代傳統(tǒng)的染色體核型分析，需要進(jìn)一步完善以降低漏診率和假陰性率。相信隨著技術(shù)的完善，QF-PCR能發(fā)揮其檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，將成為大人群篩查的優(yōu)良方法，在臨床產(chǎn)前快速診斷中發(fā)揮重大作用。

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