姚尚龍 張詩海 徐尤年

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是指機體遭受嚴重感染、創(chuàng)傷、休克、以及有害氣體吸入等多種因素打擊后，出現(xiàn)彌漫性肺泡—毛細血管膜損傷所致肺水腫和肺不張等病理特征，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥等。急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是急性肺損傷的嚴重形式[1]。自1967年美國科羅拉多大學Ashbaugh等[2]在Lancet雜志首先報道成人急性呼吸窘迫（acute respiratory distress in adult）以來， ARDS的命名和定義也逐步地規(guī)范，對ALI和ARDS的本質(zhì)和發(fā)病機制有了較為深刻的認識，并提出了ALI/ARDS臨床診斷標準和治療原則，臨床診療水平（如呼吸機支持治療）有所提高，但病死率依然居高不下[3]。 ALI和ARDS是臨床各個科室均可見到的急危重癥，由于ALI/ARDS的病因及發(fā)病機制錯綜復雜、致病環(huán)節(jié)眾多、病死率高，嚴重威脅重癥患者的生存質(zhì)量甚至影響其生命，現(xiàn)已成為臨床危重病學研究的熱點和難點。

第一部分 ALI/ARDS 的概述與分子機制

ALI和ARDS是以彌漫性肺細胞損傷為基礎[4]，以肺血管損傷所致的肺水腫和肺組織炎性細胞浸潤為其病理特征[3]，臨床上以嚴重的低氧血癥、彌漫性肺浸潤和肺水腫為主要特征。部分患者最終將會形成急性呼吸窘迫綜合征，造成機體不可逆的急性呼吸功能衰竭和多器官功能障礙。ALI 和ARDS發(fā)病危險因素可以是來自肺的直接損傷，也可以是肺外因素通過全身性炎性反應對肺產(chǎn)生的間接損傷，若同時具有兩種或三種危險因素，ARDS發(fā)病率顯著高于具有一種易患因素時。危險因素存在時間越久，ARDS發(fā)生率就越高，危險因素發(fā)生于24 h、48 h和72 h時，患病率分別為76%、85%和93%[5]，因此有必要從多方面、多角度深入探究 ALI/ARDS的發(fā)病機制，以期找到更為有效的治療途徑。

1 ALI/ARDS的分子機制

ALI/ARDS發(fā)病機制錯綜復雜，迄今尚未完全闡明[6]。目前針對ALI/ARDS發(fā)病機理的研究主要是圍繞其病理特征即肺水腫的形成和肺組織炎癥的發(fā)生和調(diào)控。

1.1 肺水腫的形成

目前認為ALI是以急性肺水腫為重要特征的一種臨床綜合征，其基本病理生理改變是肺泡上皮和肺毛細血管內(nèi)皮通透性增加所致的非心源性肺水腫。由于肺泡水腫、肺泡塌陷導致嚴重通氣/血流比例失調(diào)，特別是肺內(nèi)分流明顯增加，從而產(chǎn)生嚴重的低氧血癥。肺血管痙攣和肺微小血栓形成引發(fā)肺動脈高壓?，F(xiàn)在普遍認為急性肺損傷時發(fā)生肺水腫一方面是由于肺微血管內(nèi)皮細胞活化/損傷，局部毛細血管通透性增加，促進富含蛋白質(zhì)的血漿滲出，導致組織水“腫”；另一方面水通道蛋白的數(shù)量和功能的異常也是急性肺損傷時肺水腫形成的一個重要因素。

肺泡內(nèi)液體清除方式主要有兩種：被動轉(zhuǎn)運和主動轉(zhuǎn)運，以主動轉(zhuǎn)運為主。肺泡上皮的鈉水主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要由鈉離子通道、Na+-K+-ATP酶和水通道組成。水通道蛋白是一族廣泛存在于原核和真核生物細胞膜上的選擇性高效轉(zhuǎn)運水分子的同源蛋白質(zhì)大家族的總稱，它在液體轉(zhuǎn)運和某些腺體分泌方面具有重要作用[7]。在哺乳動物體內(nèi)已被確認的有13種水通道蛋白（AQP - 0 ~ AQP - 12），分布于肺組織中的水通道蛋白有6種（AQP - 1、AQP - 3、AQP - 4、AQP - 5、AQP - 8、AQP - 9）[8]。其中AQP - 1位于肺毛細血管內(nèi)皮細胞，只負責轉(zhuǎn)運水，不允許其他的溶質(zhì)和分子通過血管內(nèi)皮細胞。與野生型相比，AQP - 1基因敲除小鼠肺泡—毛細血管間水的滲透性、通透性是野生型的1/10，AQP - 1促進肺內(nèi)由滲透壓改變引起的水的快速轉(zhuǎn)運。在ARDS的發(fā)生過程中由于肺泡Ⅱ型細胞上AQP - 1的表達減少，造成肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)經(jīng)由水通道蛋白重吸收的水減少，水在肺間質(zhì)和肺泡聚集形成肺水腫。AQP - 3和AQP - 4主要分布在氣道上皮細胞，AQP - 5主要分布在Ⅰ型肺泡上皮細胞。通過基因敲除小鼠的實驗研究發(fā)現(xiàn)[7]，AQP - 1和AQP - 5是滲透壓改變引起的水快速轉(zhuǎn)運的重要通道，但基因敲除AQP - 1和AQP - 5不影響肺水的清除，也不增加肺損傷動物模型的肺水含量，不過敲除AQP - 5顯著地減少了粘膜下腺體分泌量（減少了50%）。

1.2 肺組織炎性細胞浸潤和細胞因子釋放

1.2.1 炎癥和炎性細胞

目前認為ALI/ARDS是肺組織對嚴重感染、創(chuàng)傷、休克及大量輸血、輸液等打擊后產(chǎn)生廣泛而過度的炎癥反應，因此炎癥反應在ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。炎性細胞主要包括多形核白細胞（PMN）、單核巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞等。機體產(chǎn)生的大量前炎癥介質(zhì)及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物（如白三烯B4等），促使炎癥細胞（尤其是中性粒細胞以及巨噬細胞）肺組織的募集及活化，構成了ALI炎性反應和免疫調(diào)節(jié)的“細胞網(wǎng)絡”，形成炎癥的“瀑布樣”鏈鎖反應，導致肺上皮細胞以及血管內(nèi)皮細胞受損，影響細胞間隙以及鈉水轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生，大量富含蛋白液體進入肺組織，形成急性肺水腫，導致透明膜的形成及肺泡的陷閉。經(jīng)過急性炎癥階段后，機體進入增生階段，出現(xiàn)肺組織的修復，滲出物的機化及淋巴細胞的浸潤，Ⅱ型肺泡上皮的增殖，分泌表面活性物質(zhì)以及向Ⅰ型肺泡上皮細胞分化，產(chǎn)生過多的細胞膠原組織，形成廣泛的纖維化，導致了肺順應性的降低，肺泡死腔的增加，患者發(fā)生頑固的低氧血癥。

目前認為， PMN上表達的趨化因子受體α、趨化因子受體4（R4）與骨髓基質(zhì)細胞上廣泛表達的基質(zhì)細胞衍生因子1的連接，是調(diào)節(jié)PMN釋放的主要因素[9]。R4受多種細胞因子的調(diào)節(jié)，如粒細胞集落刺激因子通過減少PMN細胞表面的R4的表達及促使R4的裂解，而促進骨髓中PMN的釋放[10]。促炎性細胞因子，如TNF - α、白介素- 1β（IL - 1β）等，能減少R4的表達，而抗炎性細胞因子（如IL - 4、IL - 10）則能增加ΑR4的表達。

正常生理狀況下，PMN在宿主防御中發(fā)揮著重要作用，借助其殺滅微生物活性，減輕或控制急性炎癥反應。但同時PMN壽命顯著延長[11]，通過釋放超氧化物、彈性蛋白酶等物質(zhì)導致肺組織損傷[12]。動物研究證實，選擇性耗竭PMN可以減少組織IL - 8的生成，并減輕肺損傷的發(fā)生[13]。體外研究表明，內(nèi)毒素可直接或間接激活PMN，產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶和超氧陰離子[14]。當PMN與內(nèi)毒素孵育后，將PMN再次注射入動物體內(nèi)，可誘發(fā)急性肺損傷[15]；當受到二重刺激后，內(nèi)毒素可進一步激活PMN，增強其釋放超氧化物、彈性蛋白酶和花生四烯酸類代謝產(chǎn)物的能力。PMN通過生成活性氧，彈性蛋白水解酶等物質(zhì)介導組織損傷。在炎癥反應時，通過快速凋亡機制清除炎癥局部的PMN是限制組織損傷，促進炎癥反應消退的主要機制。大量研究證實，ARDS發(fā)病時滲出至肺組織的PMN存在凋亡延遲，ARDS早期患者的BALF能在體外抑制中性粒細胞的凋亡[16]，而在ARDS晚期炎癥消除時，這種抑制作用則消失。

1.2.2 炎性介質(zhì)

在急性肺損傷炎癥反應過程中形成的炎性介質(zhì)主要包括：（1）脂類介質(zhì)：如花生四烯酸代謝產(chǎn)物（前列腺素、白三烯）、血小板活化因子（PAF）；（2）活性氧：有超氧離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）等；（3）肽類物質(zhì)：有PMNs/AMs蛋白酶、補體底物、參與凝血與纖溶過程的各種成分、細胞因子等。 在參與ARDS發(fā)病的眾多炎性介質(zhì)中，最有影響的是腫瘤壞死因子和白細胞介素。研究表明TNF - α能誘導內(nèi)皮細胞活化、白細胞遷移、粒細胞脫顆粒和毛細血管滲漏等。更重要的是TNF - α還是炎性反應級聯(lián)中至關重要的始動因子。TNF - α存在動態(tài)的表達變化，并且早于IL - 1β和IL - 8的變化，但由于TNF - α生物學活性檢測受到可溶性TNF - α受體存在的影響，鑒于ALI患者TNF - α水平升高，但可溶性TNF受體升高更為明顯，因此它們尚不能很好地預測病死率。在致炎的白介素中，IL - 1、IL - 6和IL - 8在ARDS的發(fā)病中起十分重要的作用，分別具有誘導PMN等炎性細胞趨化、釋放炎性介質(zhì)及致熱原作用等?？寡仔缘陌捉樗兀ㄈ鏘L - 4、IL - 10和IL - 13）在機體急性炎性反應中具有正向保護作用，而在ARDS時這種保護機制被明顯削弱是發(fā)病的另一重要因素。

1.2.3 細胞信號轉(zhuǎn)導通路

上述炎癥細胞和炎癥介質(zhì)構成了ALI/ARDS炎癥反應和免疫調(diào)節(jié)“細胞網(wǎng)絡”和“細胞因子網(wǎng)絡”。它們通過不同的信號轉(zhuǎn)導途徑，調(diào)控著機體的炎癥反應。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些細胞信號轉(zhuǎn)導通路與ALI/ARDS發(fā)病密切相關，如核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF - κB）信號通路、p38絲裂霉素原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導通路（MAPKs）、信號轉(zhuǎn)導—轉(zhuǎn)錄活化因子3信號通路（STAT3）等。通過特異性的阻斷這些信號通路可以不同程度的抑制炎癥細胞的活化和組織浸潤，抑制炎癥細胞因子級聯(lián)反應，從而減輕急性肺損傷。

2 ALI/ARDS治療和研究現(xiàn)狀

對于ALI/ARDS目前尚無特效的治療方法，目前主要根據(jù)其病理生理改變和臨床表現(xiàn)，采取綜合性治療措施，主要包括積極治療原發(fā)病，控制感染，支持呼吸和循環(huán)功能，防治并發(fā)癥和MODS。近年來，在ALI/ARDS治療中，呼吸機治療取得了顯著的進步。特別是小潮氣量（6 ml kg-1）、低氣道壓（< 30 cmH2O）、適度PEEP和適度PaCO2升高為特征的“肺保護性通氣策略”可以有效的改善肺泡通氣，提高PaO2，改善動脈氧合，以改善通氣效果，避免呼吸機相關性肺損傷的發(fā)生[17]。同時，對呼吸機治療以外的策略也做了很多的研究，發(fā)現(xiàn)在保證有效循環(huán)血容量、心輸出量和供氧的情況下，盡可能限制補液量，維持液體負平衡，使PCWP維持在較低的水平（14 ~ 18 cmH2O）。在血液動力學狀態(tài)穩(wěn)定的前提下，可使用利尿劑以減輕肺水腫[18]。在ALI/ARDS藥物治療方面，最近對包括一氧化氮吸入、糖皮質(zhì)激素、肺泡表面活性物質(zhì)、磷酸二酯酶抑制劑、抗真菌治療等可能對ALI/ARDS有益的藥物的一期和二期試驗研究發(fā)現(xiàn)，可以改善通氣血流比例失調(diào)，改善氧供，但在長期大樣本的對照研究中發(fā)現(xiàn)并不能降低ALI/ARDS死亡率[19]。目前，一些新的治療措施，包括活化蛋白C，粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM - CSF）和β受體激動劑吸入治療目前正在進行臨床試驗，這些方法有可能為ALI/ARDS患者的治療帶來新的希望。

目前對ALI/ARDS炎癥方面治療，主要是應用抗生素和糖皮質(zhì)激素等措施抗炎治療，抑制炎癥啟動階段促炎介質(zhì)的釋放和中性粒細胞的組織浸潤是其主旋律[20]。目前常用的針對炎癥啟動的抗炎策略雖然對急性炎癥的緩解有一定作用，然而抑制炎癥發(fā)生的治療策略也同時減弱了機體的防御能力，它勢必抑制機體內(nèi)源性抗炎及損傷組織修復機制的形成，因而蘊藏著機會感染、損傷愈合延遲、急性炎癥慢性化等隱患[21]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，促炎癥消退策略“重建炎癥自限機制、促進炎癥適時消退”是炎癥性疾病治療的理想策略。最新發(fā)現(xiàn)的促炎癥消退作用的炎癥介質(zhì)和細胞因子，主要包括脂氧素、保護素和消退素、IL-10和TGF-β[22-23]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，用血管生成素1治療急性肺損傷，可以有效的穩(wěn)定血管內(nèi)皮細胞，降低其通透性[24]，減少內(nèi)皮來源的粘附分子的表達[25]，加速炎癥消退[26]，改善急性肺損傷小鼠存活率[27]。因此，血管生成素Ⅰ可能是預防/治療急性肺損傷的一個新的策略。

綜上所述，由于ALI/ARDS的機制復雜，“細胞網(wǎng)絡”和“細胞因子網(wǎng)絡”在ALI/ARDS中起到重要作用，其相互之間的調(diào)控機制有待于進一步研究。隨著ALI/ARDS的臨床研究的不斷深入，新的治療策略的不斷改進和監(jiān)護措施的日趨完善合理，ALI/ARDS的死亡率是有望進一步降低的。

第二部分 ALI/ARDS 的遺傳學研究

流行病學調(diào)查資料表明，ALI的發(fā)生和預后依賴于疾病本身和個體對疾病的敏感程度。目前，普遍認為人類疾病的發(fā)生都直接或間接與基因受損有關，遺傳因素是內(nèi)因，環(huán)境因素是外因，人類疾病是遺傳因素（基因組信息）與環(huán)境因素相互作用的結果。然而，即使暴露于相同的危險因素下，不同個體對ALI/ARDS的免疫應答、所啟動的炎癥反應程度以及預后也不同。這種差異性被稱為遺傳易感性，是由于在進化過程中遺傳物質(zhì)不斷變異，導致一種基因可能有幾種基因型，即基因的多態(tài)性。其原因可以是某一基因位點上存在兩個或兩個以上不同的等位基因，是單個堿基改變（單核苷酸多態(tài)，SNP），堿基或DNA片段的缺失或插入，基因的重復，也可由某些高度重復序列拷貝數(shù)變異造成。

ALI/ARDS危險因素眾多，但發(fā)展成ALI/ARDS的病人比例并不高，且患者的轉(zhuǎn)歸各不相同，表明具有明顯的個體差異。Moss等[28]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人感染性休克并發(fā)ALI的幾率比非糖尿病病人要低（25%vs.47%），導致這一結果的原因可能與患者的基因異質(zhì)性有關。目前評價影響ALI/ARDS發(fā)病及預后的基因主要集中在以下幾個方面：（1）引起炎性反應的細胞因子基因，如Toll樣受體4（Toll - like recepror 4，TLR4），Nrf2（nuclear factor, erythroid derived 2，like 2），腫瘤壞死因子等；（2）編碼肺泡產(chǎn)物的基因，如肺泡表面活性物質(zhì)；（3）凝血途徑相關的因子。本節(jié)的重點是就近年來的與ALI/ARDS高發(fā)病率相關的遺傳基因方面研究成果做一介紹，給今后致力于急性肺損傷相關方面研究的讀者以啟發(fā)。

1 TLR4與ALI/ARDS

TLR4是一種跨膜蛋白，人類編碼的基因定位在9q32 - q33。這種蛋白由胞外區(qū)、跨膜段和胞內(nèi)區(qū)3部分組成。其胞外區(qū)主要包括十幾到二十幾個串連的富含亮氨酸重復序列（1eucine - rich repeats，LRRs），此結構有利于促進蛋白質(zhì)間的相互粘附，故可用來識別病原體或其產(chǎn)物。胞內(nèi)區(qū)由Toll同源結構域（Toll Homology domain，TH domain）和分子羧基端長短不同的短尾肽組成。TH結構域是向下游進行信號轉(zhuǎn)導的核心元件，這一區(qū)域關鍵位點的突變或序列缺失將阻斷信號向下傳遞。當編碼刪的基因突變，就會導致其編碼蛋白改變，從而使信號傳導發(fā)生變化，影響一系列反應。

TLR4是Toll樣受體家族唯一的既表達于中性粒細胞，又表達于內(nèi)皮細胞的成員。病原微生物抗原和內(nèi)源性抗原等配體被肺內(nèi)中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等細胞表面的TLR4識別后，在ALI/ARDS早期通過激活NF-κB和AP - 1等轉(zhuǎn)錄因子從而激活細胞，啟動一系列炎癥免疫反應。這些效應包括產(chǎn)生許多種能擴大免疫炎癥反應、增強殺菌作用的細胞因子如IL - 1、IL -6、IL - 8、IL - 12、TNF - α等[29]，引發(fā)以中性粒細胞浸潤、微血管內(nèi)皮細胞損傷與蛋白液體滲漏為特征的炎癥反應。絲裂原激活蛋白激酶（mitogen - activated protein kinase，MAPK）是細胞內(nèi)一類重要的信號分子，LPS可以通過TLR4將信號轉(zhuǎn)導至細胞內(nèi)并導致各條MAPK通路的激活，但是具體的激活機制還不清楚。此外，在ALI/ARDS后期，TLR4介導炎癥反應修復，以維持肺泡上皮細胞的修復，促進ALI/ARDS的康復[30]。

Steven等對C3H/Hej（突變型純合子，對LPS不敏感品系）和C3H/HeOuj（野生型純合子，對LPS敏感品系）2種小鼠染毒，比較肺泡灌洗液中蛋白的含量。發(fā)現(xiàn)在C3H/HeOuj品系小鼠灌洗液中蛋白含量明顯高于C3H/Hej品系小鼠；并且用RT - PCR的方法檢測了TLR4的mRNA的表達量，發(fā)現(xiàn)C3H/HeOuj品系小鼠mRNA的表達量比對照組高40%；而C3H/Hej品系小鼠在O3染毒72 h后沒有發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA的表達[29]。而Qureshi等人研究發(fā)現(xiàn)C3H/Hej品系小鼠在編碼TLR4的基因的712位點上的密碼子中有一個堿基突變“C -A”，導致了此位點上的脯氨酸被組氨酸取代，而此部分位于胞內(nèi)區(qū)，可能正是這種原因?qū)е铝诵盘杺鲗У母淖?，影響了下面一系列反應[31]。

2 Nrf2與ALI/ARDS

Nrf2是一種核轉(zhuǎn)錄因子，小鼠的編碼基因定位在2q31。Nrf2是基于亮氨酸拉鏈核轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，這個家族有6個成員：p45 - Nfe2，Nrf1，Nrf2，Nri3，Bachl和Bach2[32]。Nrf2能夠與NF - E2/AP -1重復序列結合。NF - E2/AP - 1是抗氧化反應元件（antioxidant response elements，ARE）的一個亞族，具有GCNNNGTCA序列，這些序列存在于幾種2相解毒酶和抗氧化蛋白基因的啟動子區(qū)，通過和Nrf2轉(zhuǎn)錄因子結合來調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[33]。這些下游基因包括：谷胱苷肽硫轉(zhuǎn)移酶（GSTs）基因、還原型輔酶II（NADPH）基因、苯醌氧化還原酶（NQOI）基因、谷胺酸半胱氨酸連接酶（Glutamate - cysteineligase）基因等，這些基因在解毒和抗氧化反應中起著重要的作用，同時還和腫瘤的發(fā)生有密切的關系[34]。

Cho等[35]用活性氧物質(zhì)對C57BL/6j、C3H/Hej以及F1和F2代小鼠染毒，然后做基因連鎖分析，結果發(fā)現(xiàn)小鼠的第2、3號染色體上發(fā)現(xiàn)了幾個數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL），分別為對活性氧物質(zhì)易感的Hsl1和Hsl2基因。經(jīng)過比較Hsll的基因序列，推斷出Nrf2可能為候選的易感基因[35]。檢測C57BL/6j（易感品系） 和C3H/Hej （抵抗品系）兩種品系小鼠肺部Nrf2 mRNA的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)：在染毒后的l.5 h、6 h和48 h C3H/Hej品系小鼠肺部的mRNA表達的量分別比C57BL/6j品系小鼠高62%、64%和260%。對兩種品系小鼠啟動子區(qū)的基因進行比較發(fā)現(xiàn)，C57BL/6j品系小鼠在 - 89處有一個“G - C”的突變：在 - 197、 - 336和 - 479處都有“T – C”的突變；在 -519處的多聚“C”位點有一個額外的“C”，而C3H/Hej品系小鼠的多聚“C”只到 - 518處，這可能是因為在Nrf2啟動子區(qū)的多態(tài)性導致了兩種品系小鼠之間Nrf2轉(zhuǎn)錄水平的不同，影響2相解毒酶和抗氧化蛋白的翻譯，從而導致了兩種小鼠之間對活性氧物質(zhì)反應的差異。

Aoki等人用基因敲除技術，將小鼠的Nr/2基因敲除，然后用柴油機廢氣對Nrf2（-/-）和Nrf2（+/-）2種小鼠染毒，檢測肺部DNA加合物的含量。結果發(fā)現(xiàn)Nrf2（-/-）小鼠肺部DNA加合物的含量是Nrf2（+/-）小鼠的2.3倍[36]。Chan等[33]用丁羥甲苯（消毒防腐藥，butylated hydroxyl toluene，BHT）對Nrf2基因敲除的小鼠和野生型小鼠進行染毒，結果發(fā)現(xiàn)在染毒第2天兩種小鼠均出現(xiàn)淺快呼吸、毛色失去光澤以及小鼠背部弓起，且在Nrf2（-/-） 小鼠癥狀更加明顯，大部分都死亡。同時，還檢測了兩種小鼠肺部的一些解毒酶的含量，發(fā)現(xiàn)在Nrf2（-/-）小鼠肺部的過氧化氫酶、谷胺酸半胱氨酸連接酶、血紅素加氧酶、還原型輔酶Ⅱ、苯醌氧化還原酶、過氧化物歧化酶等2相解毒酶的含量均比野生型小鼠低，說明其肺部抗氧化損傷能力比較低，容易造成肺部的損傷。

3 腫瘤壞死因子基因與ALI/ARDS

腫瘤壞死因子是膿毒血癥的重要炎性介質(zhì)，而膿毒血癥是誘發(fā)ARDS的最常見原因。TNF - α僅和TNF -β作用于相同的受體引起多種生理反應。循環(huán)內(nèi)高TNF - α水平證明與敗血癥的預后明顯相關，例如腦膜炎球菌敗血癥[37]。

TNF - α主要由巨噬細胞分泌，而TNF - β主要由淋巴細胞分泌，編碼這兩個因子的基因是位于第6號染色體人白細胞抗原III基因族內(nèi)的相鄰基因。由于其位置毗鄰并且具有高度的同源性，因此進化學的研究表明兩種因子的基因來自于同一個祖先，是在進化過程中復制而成的。人白細胞抗原與自身免疫性疾病有關，TNF - β第1內(nèi)含子NcoI限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性等位基因與胰島素依賴性糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病有關，具有TNF - β2純合子等位基因的個體比雜合體和TNFB純合子個體在脂多糖刺激下單核細胞分泌的TNF - α都要高[38]。

研究表明，在TNF - α基因（TNFA）控制區(qū)的多態(tài)性與病人對感染性休克、器官功能衰竭（MOF）和死亡率的易感性明顯相關。Stuber等[39]研究了位于TNFA啟動子308位點的Ncol限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性與敗血癥病人MOF和血漿中TNF-α濃度的相關性。研究結果表明，TNFA的多態(tài)性與病人血漿中TNF-α水平升高和預后較差有明顯的相關性：在17名TNF-β2純合子的基因型的患者中有2名患者生存，而在19名雜合子基因型的患者中有12名患者生存下來，具有TNF-β2純合子等位基因患者的死亡率比雜合子基因型的死亡率明顯增高（88% vs.37%）。另外，TNF-β2純合子基因型的患者比雜合子基因型的患者循環(huán)內(nèi)TNF-α的濃度較高，器官衰竭的評分也較高。另一項研究表明，具有TNF-β2等位基因的患者不但對感染性休克具有很高的死亡率而且與感染性休克的易感性相關?？傊?，在機體處于炎癥反應時，具有TNF-β2純合子基因型的患者的死亡率更大。

4 肺泡表面活性蛋白B基因與ALI/ARDS

表面活性蛋白對于肺的正常功能具有重要作用。能夠通過干擾肺泡水層分子間的作用力，降低肺泡表面張力，使肺處于正常的膨脹狀態(tài)。是由肺泡II型細胞分泌的包含多種脂類和表面活性蛋白（SP）（SP-A，SP - B，SP - C和SP - D）。SP - A既具有肺泡表面活性物質(zhì)的生理作用，又是肺局部防御和炎癥反應過程的重要介質(zhì)。對基因敲除小鼠和人先天性蛋白沉積癥病人研究的結果表明，缺乏SP - B的動物和人是無法生存的。雜合子SP - B小鼠SP - B分泌的總量只有正常小鼠的一半，表現(xiàn)為順應性減小，肺內(nèi)的殘留氣體增加。SP - D和SP - A一樣是C類膠原蛋白，在肺局部防御中具有重要作用[40]。SP與ALI的病理過程密切相關，ALI病人的SP降低肺泡表面活性的能力減弱，肺泡灌洗液中SP - B的含量減少。同時血漿白蛋白滲漏到肺泡內(nèi)也抑制了SP的正常功能[41]。

SP - B是由2號染色體短臂上的單基因編碼。SP-B基因的多態(tài)性是在SP-B基因的第4內(nèi)含子中存在一個不定數(shù)串列重復區(qū)，90%的白人在第4內(nèi)含子中有一段固定不變的或野生型的2.5 kb的片段，但是有些人在該區(qū)域由于插入突變或缺失突變因此存在一段或長或短的可變區(qū)?；蚪M分析的結果表明，發(fā)生ARDS的小兒該處發(fā)生突變的機會是29.3%，而對照組小兒只有16.8%（P < 0.05）[42]。在另一項研究中，SP - B基因第4內(nèi)含子發(fā)生插入或缺失突變的幾率在ARDS的病人是46.6%，而對照組只有4.3%（P < 0.05）[43]。Gong等[44]對189名有發(fā)生ARDS危險的病人進行了研究，結果只有72名（38%）患者發(fā)生了ARDS，其中具有SP - B多態(tài)性基因婦女的發(fā)病率比純合子野生型SP - B基因的發(fā)病率明顯增加。這些研究都表明SP - B基因的多態(tài)性可能與ALI的易感性有關。

5 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶基因與ALI/ARDS

在人體的很多系統(tǒng)，包括肺在內(nèi)都存在著局部腎素—血管緊張素系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）是一個關鍵酶，可將血管緊張素I（AT- I）轉(zhuǎn)化成AT - II，同時還能降解緩激肽，因此它的別名就叫激肽酶II，這兩種分子和相關肽都具有多種作用。大量的實驗證據(jù)表明，肺部腎素—血管緊張索系統(tǒng)可以改變血管的滲透性、血管的緊張度和纖維母細胞的活性，從而影響ARDS的病理進程[45]。

在ARDS病人，循環(huán)中的ACE通常是降低的，這說明受損的肺泡內(nèi)皮細胞釋放的酶減少，但在BAL內(nèi)ACE的含量就明顯升高，肺組織和血液間AT - II的梯度較大[46]。血漿中ACE的濃度存在著明顯的個體差異，但是在家族中這種差異卻很小，說明有遺傳因素的影響。人類ACE基因是由4 024個堿基對構成，其上存在或缺失一段含有287個堿基的DNA片段，有者為插入型，純合子基因型為I/I，無者為刪除型，純合子基因型為D/D，雜合子基因型為I/D，D/D基因型患者的ACE基因表達高于I/I基因型患者[47]。Jerng等[48]對臺灣國立醫(yī)學院ICU中的101例ARDS患者、138例具有ARDS危險因素者和210名健康人進行了基因分型。結果顯示，I/I、D/D、I/D這三種基因型在三組內(nèi)出現(xiàn)頻率的差異無統(tǒng)計學意義，但是這三種基因型的患者28 d病死率的差異有統(tǒng)計學意義（I/I：40，I/D：65，D/D：75，P=0.036），表明ACE基因I/D多態(tài)性是判斷ARDS患者預后的重要因素。因此ACE抑制劑或者血管緊張素受體阻滯藥物可能會起到治療效果。這個效果在Wang等[49]用博萊霉素誘導的ALI小鼠模型實驗中得到驗證。

6 凝血相關基因與ALI/ARDS

敗血癥、創(chuàng)傷等AL/ARDS I的危險因素可以同時激活炎癥和凝血反應，這兩種反應之間可以相互影響，某些炎性介質(zhì)可以促進凝血，反過來，血管內(nèi)凝血也可以誘導炎癥反應。二者通過內(nèi)皮細胞緊密的聯(lián)系起來。TNF - α、IL - 1和IL - 6等炎性介質(zhì)可以直接損傷內(nèi)皮細胞，或者通過激活中性粒細胞間接損傷內(nèi)皮細胞，血小板從積聚在損傷的內(nèi)皮細胞釋放，從而引發(fā)凝血反應。TNF - α等細胞因子還可以誘發(fā)組織囚子（TF）表達，從而激活外源性凝血途徑。細胞因子還可以同時激活抗凝系統(tǒng)，這種抗凝和促凝反應的平衡對于血管內(nèi)凝血的擴散具有重要作用。反過來，凝血可以誘導外周血單核細胞和內(nèi)皮細胞釋放IL - 6，IL - 8和TNF - α，從而影響炎癥反應[50]。ALI的早期，由于抗凝和促凝的平衡被打破，纖維蛋白沉積在肺泡，提高趨化作用和肺泡的通透性從而增加炎癥反應的程度。在ALI患者的BAL中，促凝劑活性升高而纖溶活性下降，因子VII（促凝）和PAI - 1活性（抗凝）增加。

炎癥反應和凝血反應某些關鍵因子基因的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）或SNP單體型可以增加促凝，破壞抗凝和纖溶，促進ALI/ARDS的發(fā)生和發(fā)展。凝血酶、纖維蛋白原、V因子、VIII因子、蛋白質(zhì)C、內(nèi)皮蛋白質(zhì)C受體、蛋白質(zhì)S、抗凝血酶和PAI - 1這些凝血系統(tǒng)關鍵因子基因的啟動子和編碼區(qū)都發(fā)現(xiàn)了SNPs。大量的研究表明，這些SNPs與深靜脈血栓、肺栓塞、急性心肌梗死、猝死、中風及ALI/ARDS有關[51]。

在PAI - 1基因的啟動子存在著4Gs或5Gs，被命名為PAI - 4G/5G。5G等位基因與血漿中PAI - 1升高有關。很多研究[52-53]發(fā)現(xiàn)，ALI/ARDS患者血漿和肺泡灌洗液中的PAI - 1濃度升高且與預后呈負相關。Tsangaris等[54]近來研究發(fā)現(xiàn)，具有4G等位基因的ALI/ARDS患者需要呼吸機支持治療的時間更長，更容易發(fā)生多器官功能障礙，28天死亡率更高。同樣，在對多發(fā)性創(chuàng)傷的患者研究發(fā)現(xiàn)，具有4G等位基因死亡率較高，這些患者不但PAI - 1的水平較高而且具有較高濃度的TNF - α和IL - 1。4G/4G純合子的患者PAI - 1、TNF -α和IL - 1的濃度最高，4G/5G雜合子或5G/5G純合子患者PAI - 1、TNF - α和IL - 1的濃度較低[55]。

7 其他基因

Leikauf[56-57]等在第6號染色體上發(fā)現(xiàn)了很多有意義的數(shù)量性狀位點，包括轉(zhuǎn)化生長因子（TGF - α）和水孔蛋白1基因。由于TGF - α在起始和維持肺修復時具有重要作用，因此在ALI模型中應用TGF - α取得了初步成功，過表達TGF - α的轉(zhuǎn)基因小鼠的存活率與表達的 TGF - α的量明顯相關。這些研究結果提示，TGF - α在肺內(nèi)可以限制急性炎癥反應，對ALI具有保護作用。Zhai等[58]對1 253例ICU患者的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因多態(tài)性（- 460C/T、+ 405C/G、-936C/T）與患ARDS的危險性進行了研究，發(fā)現(xiàn)VEGF基因多態(tài)性可能與ARDS患者預后有關，還與VEGF在不同個體中的循環(huán)濃度有關。

肌球蛋白輕鏈激酶（myosinlightchainkinase，MYLK）基因激活中性粒細胞穿越內(nèi)皮細胞屏障，啟動中性粒細胞的級聯(lián)反應，導致ALI/ARDS。Gao等[59]對MYLK基因進行全序列掃描后發(fā)現(xiàn)-rs820336基因G-A堿基突變對兩組病例發(fā)生ALL都有顯著影響。AA基因型頻率在非洲裔美國人中的頻率為1.7%，GG基因型頻率為55.8%，而在ALI患者中從基因型頻率升高到23.9%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），AA基因型發(fā)生ALI的風險是DD型的18倍。而在歐洲裔美國健康人群中AA基因型頻率為60.7%，ALI患者的頻率為45.5%，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），GG基因型頻率在健康人群是3.6%，而在ALI患者中是13.6%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），GG基因型發(fā)生ALI的概率是AA型的5倍。在非洲裔美國人中有CAG標識的hcvl602689、MYLK - 007及rsll707609單倍體在ALI患者的頻率為11%，而在僅膿毒癥患者的頻率為1%。

8 結語

在醫(yī)學臨床實踐或動物實驗中，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)機體在遭受創(chuàng)傷或損傷因素作用后，不同個體的反應性是有差異的，雖然目前對這種創(chuàng)傷反應差異性的發(fā)生機制尚不明確，但可以肯定的是與個體遺傳背景的差異相關。隨著人類基因組計劃和各種模式生物基因組計劃的完成，大規(guī)?；蚪M表達的功能基因組研究方法（cDNA芯片）和基因組分析法為研究肺損傷的基因遺傳性提供了全新的視角。通過深入研究ALI/ARDS的分子遺傳學機制，必定會豐富現(xiàn)有對ALI/ARDS的認識以及為個體化治療提供理論依據(jù)。

第三部分 ALI/ARDS 的動物模型

ALI/ARDS動物模型的建立是實驗室細胞分子水平研究和臨床研究的橋梁。為了研究ALI/ARDS的機制，可以通過基因敲除或者是用藥物阻斷某個基因產(chǎn)物或者信號通路在動物模型上觀察其在ALI/ARDS的作用。因此，ALI/ARDS的動物模型的建立及應用在了解掌握ALI/ARDS發(fā)病機制、病理生理改變中占有重要的地位。

1 實驗動物種屬之間的差異

ALI/ARDS模型動物的可選擇種類相當廣泛，包括大鼠、小鼠、兔、犬、豬、綿羊、山羊及靈長類動物等，每種動物都有它獨特的特點。由于ARDS病因復雜，但可歸為直接原因和間接原因兩大類[60]，分別形成肺源性和肺外源性ALI/ARDS。越來越多的人認為肺源性和肺外源性的ALI/ARDS在發(fā)病機制、治療效果等多方面存在差別[6]，即使是同一種給藥途徑，不同的藥物對不同種屬，甚至同一種屬不同年齡動物的肺損傷的程度和機制也是不盡相同的。這都是我們在選擇合適的ALI/ARDS模型的時候必須考慮的問題。

1.1 動物先天性免疫系統(tǒng)之間的差異

由于動物和人類生存在不同的環(huán)境中，因此各自都對周圍環(huán)境中的微生物形成了一定的免疫力，白細胞和間質(zhì)細胞通過TOLL樣受體4（TLR4）識別微生物。Hajjar和同事[61]研究發(fā)現(xiàn)，人類和鼠類TLR4識別內(nèi)毒素的結構位點是不同的。其他的研究[62]也發(fā)現(xiàn)，不同種數(shù)之間的TLR2、TLR3、TLR7、TLR8、TLR9也是不同的。

1.2 不同種屬之間的單核巨噬細胞系統(tǒng)也是不同的

單核巨噬細胞系統(tǒng)包括巨噬細胞及其前身單核細胞。在很多種屬，單核巨噬細胞系統(tǒng)位于脾臟和肝臟血流中，如狗、大鼠、小鼠、兔子等；但在某些種屬單核巨噬細胞系統(tǒng)存在于肺組織的血液中，比如綿羊、山羊、牛、豬等。肺泡內(nèi)單核巨噬細胞系統(tǒng)的存在增加了肺損傷的易感性[63]。

1.3 不同種屬之間的NO以及趨化因子和趨化因子受體也是有差別的

臨床和動物實驗證實，NO、IL - 8及其受體CXCL8都參與了ALI/ARDS的形成和發(fā)展[64-66]。巨噬細胞殺死結核分枝桿菌的機制，在人類是維生素D劑量依賴性的[67]，而在小鼠和一些夜間活動為主的、接受日光照射比較少的動物呈NO劑量依賴性[68]。并且嚙齒類動物巨噬細胞比人類非活化的巨噬細胞NO的產(chǎn)量大很多[69]，山羊、猴子、豬類等像人類非活化的巨噬細胞一樣幾乎不產(chǎn)生NO[70-71]。NO產(chǎn)量的這種種屬之間的差異是我們解釋動物實驗的結果和分析人類ALI/ARDS機制的時候必須要考慮的因素。另外在選擇實驗動物的時候，也要根據(jù)實驗設計需要考慮動物的體型大小和完成課題所需要的種屬特異性的試劑盒。有些實驗需要反復采血或者采血量比較大，或者需要測量一些生理指標，如血壓、心率、血氣等，采用體積稍大的動物如羊、兔、豬或者猴子等就更合適，但由于實驗研究最多用的還是小型動物，小型動物指標檢測試劑盒種相對比較齊全，大型動物的指標檢測試劑盒相對比較稀缺，這也是在實驗動物選擇時需要考慮的重要因素。

2 ALI/ARDS動物模型

2.1 ALI/ARDS動物模型分類和特點

2.1.1 肺內(nèi)型

（1）灌洗型 整肺灌洗型包括離體和在體兩種。其發(fā)病機制是由于肺表面活性物質(zhì)的喪失而造成肺不張，蛋白漏出，肺透明膜形成及肺水腫[72]。該模型主要用于肺表面活性物質(zhì)替代治療及肺表面活性物質(zhì)缺乏在ALI中的作用等方面的研究。這種模型低氧血癥顯著而血液動力學穩(wěn)定。由于海水和淡水成分不同，故有學者復制了海水型ALI的動物模型，用于研究海水溺水的救治。

（2）吸入或者氣管內(nèi)滴入型 霧化或者是從氣管內(nèi)注入化學物質(zhì)或者是炎癥因子（如鹽酸、內(nèi)毒素、TNF - α）均可使麻醉后動物發(fā)生ALI。吸入后既可直接損傷支氣管肺組織、肺泡-毛細血管膜，還可誘發(fā)肺內(nèi)的化學性炎癥從而導致通透性的肺水腫。此種模型循環(huán)功能穩(wěn)定，組織損傷基本局限于肺部，是對胃內(nèi)容物的誤吸所致ALI的模擬[73]。

（3）機械通氣相關肺損傷 用20 ml kg-1的潮氣量、85次 分-1的呼吸頻率，2小時可誘發(fā)大鼠的肺損傷。其致病機制在于肺組織的過度膨脹造成的血管透壁壓和滲透性增加，是否有炎性因子參與肺損傷及參與的程度尚不清楚[74]。此模型主要用于機械通氣并發(fā)癥的研究。

（4）脂肪微栓塞型 嚴重創(chuàng)傷尤其是骨折后脂肪釋放入血，造成血管微栓塞引發(fā)一系列反應，在肺損傷的發(fā)病機制中占有重要地位。這種模型共同的發(fā)病機制包括：①靜脈注射后損傷血管內(nèi)皮細胞，破壞肺表面活性物質(zhì)；②引起化學性炎癥：激活凝血系統(tǒng)，補體通路，趨化中性粒細胞；③機械性阻塞肺微血管床。

2.1.2 肺外型

（1）胰腺炎并發(fā)肺損傷 通過胰管內(nèi)注射?；悄懰徕c（4% 0.5 ml，大鼠）或靜脈注射磷脂酶A2（PLA2）和胰蛋白酶可復制該模型。其發(fā)病機制是：①低血壓休克使肺灌注不足；②PLA2活化；③游離脂肪酸的增多；④緩激肽引起血管擴張和通透性上升；⑤高凝狀態(tài)。此種模型更符合臨床疾病的病理生理變化過程，經(jīng)多位學者的改進，技術已較成熟。但是對技術要求相對較高，動物容易發(fā)生膽漏、腸漏等使模型失??；同時也缺少酒精和膽石兩個人類ALI發(fā)病中的重要因素[75]。

（2）盲腸結扎/膿毒癥型 是經(jīng)腹手術在動物盲腸上刺孔并結扎使動物發(fā)生組織壞死和腸源性腹腔感染導致SIRS，進一步發(fā)展成ALI。發(fā)病機制除了內(nèi)毒素造成以外，還存在腸道其它細菌毒素的致傷作用、手術打擊等。故此種模型病情重，肺部病理損害也明顯，是較理想的ALI模型之一[6]。

（3）缺血再灌注性肺損傷 血管部位可選肺動脈或肺外動脈，均可導致肺損傷。Koike等[9]通過阻斷腸系膜上動脈45 min后放開再灌注建立了大鼠缺血再灌注ALI動物模型。發(fā)病機制是在腸缺血再灌注時，血液系統(tǒng)中炎癥因子激活，從而造成了肺損傷。如選用肺動脈，則多與肺移植后的肺損傷研究有關。

2.2 致傷標準與模型評價

由于臨床病例資料（尤其是病理資料）收集存在一定的困難，故動物模型在研究ALI中發(fā)揮了很大作用，但同時動物模型的復制也是ALI的研究的難點[6]。雖然人的ALI/ARDS診斷標準早已出臺，但是炎癥反應是一個緩慢的過程，早期即出現(xiàn)炎癥因子和炎性細胞浸潤，發(fā)展到一定的程度才出現(xiàn)功能的改變，如頑固性低氧血癥。實驗發(fā)現(xiàn)[76]，由于動物實驗中的個體差異，氧合指數(shù)離散度比較大，臨床上使用的氧合指數(shù)能否作為ALI/ARDS動物模型制作成功與否的金標準尚存爭議。另外，在外界刺激因素的作用下，肺組織受到的損傷過程隨著時間的變化而變化，因此理想的ALI/ARDS動物模型應該復制人類ALI/ARDS疾病過程中所有的病理生理變化過程，但ALI/ARDS的死亡率比較高，很難保證模型動物能夠長期存活。目前國內(nèi)外的ALI/ARDS模型動物、致傷因素、致傷方法等均存在著多樣化，一般都是在諸如內(nèi)毒素、脂肪栓塞、胃酸誤吸、缺血再灌注損傷等ALI/ARDS的發(fā)病的高危因素的基礎上，根據(jù)研究目的的不同，選擇的合適的實驗動物種類和模型制作方法。

3 問題與展望

現(xiàn)有的動物模型實驗時間短，不利于長期觀察。而且模型的穩(wěn)定性也不盡如人意。實驗中原來健康實驗動物突然遇到致病因素后迅速發(fā)病，而臨床上患者在高危因素作用下多在24 ~ 48小時后才相繼出現(xiàn)ALI/ARDS的表現(xiàn)。二者在發(fā)病時間上有一定的差距。另外，ALI/ARDS病人肺損傷的嚴重程度還受到臨床支持治療措施（如機械通氣、液體治療等）的影響[77]，這無疑增加了模擬這種ALI/ARDS過程的難度。多數(shù)的大型動物在實驗時均采用仰臥位，與動物的生理體位相背，而在多數(shù)實驗中沒有對此造成的通氣血流失衡進行分析。在動物實驗中應遵循“三R”原則：減少，替代，優(yōu)化（reduction，replacement，refinement），既達到實驗的目的又減少動物的痛苦體驗。盡管目前沒有一個模型能夠完整的復制出人的ALI/ARDS特點，但只要相關的實驗結果能夠得到很好的詮釋和總結，仍將為人類ALI/ARDS某些治療/預防和機制研究作出巨大的貢獻。

第四部分 機械通氣相關肺炎的發(fā)生機制

機械通氣相關肺炎（ventilator associated pneumonia，VAP）是指氣管插管或氣管切開并行機械通氣 ≥ 48 h后，停用機械通氣和拔除氣管導管后48 h內(nèi)發(fā)生的新的感染性肺實質(zhì)炎癥（不包括非創(chuàng)傷性機械通氣）[78]。VAP是醫(yī)院內(nèi)獲得性肺炎最常見的類型之一，接受機械通氣治療的患者一旦出現(xiàn)發(fā)熱、白細胞增多、咳嗽咳痰、呼吸節(jié)律的改變以及肺浸潤影都應該考慮到VAP的發(fā)生。與無VAP患者相比，VAP患者住院時間長，醫(yī)療成本高，死亡率高達25% ~ 50%[79]。宿主的呼吸道防御機制破壞和病原微生物定植及侵入呼吸道是VAP發(fā)病機理的關鍵。

1 呼吸道防御機制

呼吸道面對入侵的病原微生物的威脅，只有依靠其強大的防御機制和機體的協(xié)調(diào)能力，才能與之抗衡。正常呼吸道有多重防御機制抵抗病原菌的侵入，包括機械防御（纖毛上皮和黏液清除系統(tǒng)）、體液免疫（抗體和補體）、細胞免疫。在老年人、意識障礙的患者、內(nèi)環(huán)境紊亂、多器官功能不全以及吸煙酗酒的患者，由于咳嗽吞咽等保護性反射的減弱甚至消失以及其他的原因造成機體的免疫力低下，促進了細菌的定植和VAP的發(fā)生。

人工氣道的建立（如氣管插管和氣管切開），有效的保證了氣道的通暢，但同時也破壞了呼吸道的正常防御機制，為病原微生物的入侵打開了門戶。氣管插管不僅跨越了會厭部防御屏障、損傷了氣管黏膜，使病原微生物容易定植于氣管、支氣管，而且削弱了咳嗽反射和纖毛運動、加重氣管導管球囊上分泌物的革蘭陰性菌污染、早期（<8 h）即可導致氣管導管內(nèi)細菌生物被膜的形成，易使污染的分泌物進入下呼吸道[80]。長時間的氣管導管留置增加了患者感染和誤吸的風險，并且容易發(fā)生胃腸道蠕動和微血管功能紊亂[81]。經(jīng)鼻氣管插管還能誘發(fā)院內(nèi)鼻竇炎，Holzapfel[82]等通過病例對照研究發(fā)現(xiàn)針對鼻竇炎檢查和治療可減少機械通氣患者VAP的發(fā)生，試驗組VAP發(fā)生率為34%，而對照組為47%。無創(chuàng)正壓通氣曾被認為是拔管失敗后重復插管的有效替代措施，但近期的一項大型國際多中心研究[83]則否定了這一點，因為與重復插管相比，無創(chuàng)正壓通氣既不能降低患者死亡率，也不能延長生存時間。當然，在降低VAP的發(fā)生率方面，與氣管插管或者氣管切開后行機械通氣相比，無創(chuàng)機械通氣患者VAP的發(fā)生率顯著的減少[84]。氣管切開，減少喉損傷，可較好地吸引分泌物，便于進行口腔護理，減少套管阻塞和細菌定植的發(fā)生。氣管切開降低了氣流阻力，減小了導管死腔，降低自主呼吸功，改善患者的舒適感，也減少鎮(zhèn)靜劑的使用。研究[85]證實早期（機械通氣24 h內(nèi)）氣管切開與晚期（機械通氣2周后）氣管切開相比可顯著降低VAP的發(fā)生率，兩組VAP發(fā)生率分別為5%和25%（P < 0.01）。

2 機械通氣時病原微生物定植及侵入呼吸道

2.1 胃內(nèi)細菌定植和胃食管反流

生理狀態(tài)下胃酸的存在使進入胃內(nèi)的細菌無法存活。當機體處于應激狀態(tài)或應用制酸藥物導致胃液pH上升，尤其胃液pH > 4時，細菌（特別是革蘭陰性桿菌）即可在胃內(nèi)定植。胃內(nèi)細菌定植是VAP的重要危險因素。胃食管反流是多種因素共同作用的結果：鎮(zhèn)靜劑或肌松劑導致的食管蠕動能力減弱，仰臥體位、胃管導致的食管下端括約肌松弛。Ibanez等[86]研究證實即使有氣管導管充氣套囊的存在，胃反流物還是能夠進入下呼吸道。Kostadima等研究[87]發(fā)現(xiàn)對機械通氣患者行早期胃造口術可減少VAP的發(fā)生，試驗組和常規(guī)經(jīng)鼻胃管組的VAP發(fā)生率分別為12.5%和44.4%，但該研究樣本量小，有待進一步臨床驗證。胃動力藥物對VAP的影響尚存在爭議。Orozco - Levi等[88]發(fā)現(xiàn)只有聯(lián)合應用帶氣囊的胃管和半臥體位才能延緩并減少胃食管反流和下呼吸道誤吸，進而推測該方法可減少VAP的發(fā)生。不過氣囊壓力及維持時間，長期安全性方面問題尚待研究。

2.2 口咽部定植病原微生物的誤吸

Ewig等[89]研究發(fā)現(xiàn)，機械通氣早期（高峰2 ~4 d）上呼吸道定植菌以肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和流感嗜血桿菌（I類病原微生物）為主，之后革蘭陰性腸桿菌屬和假單胞菌屬細菌（Ⅱ類病原微生物）迅速增加。上呼吸道是定植于下呼吸道的I類病原微生物“儲存庫”，短期抗生素治療雖可減少I類病原微生物的下呼吸道定植和早發(fā)性VAP，但卻是Ⅱ類病原微生物定植下呼吸道的危險因素，持續(xù)使用抗生素則是晚發(fā)性VAP的獨立危險因素，但病原微生物定植于危重癥患者口咽部的確切機理尚不明確。Bergmans等研究[90]發(fā)現(xiàn)在不影響胃腸道定植菌的前提下，局部預防性使用抗生素（慶大霉素／多黏菌素E／萬古霉素）凝膠可降低VAP的發(fā)生，抗生素凝膠組與安慰劑組的VAP發(fā)生率分別為10%和31%（P=0.001）。Silvestfi等[91]發(fā)現(xiàn)，接受選擇性消化道除菌治療的機械通氣患者口咽部應用萬古霉素凝膠可有效預防下呼吸道金黃色葡萄球菌和腸球菌感染的發(fā)生，且非常安全，性價比高。但該局部應用抗生素是否引發(fā)耐藥菌的產(chǎn)生、是否作為降低VAP發(fā)生率的預防性用藥等問題尚存在爭議[92]。

2.3 氣囊上滯留物的移行

氣囊上滯留物，包括口腔和胃腸道分泌物，存在于氣管插管患者的聲門下與氣管導管氣囊之間的間隙，常被革蘭陰性菌污染，該積液經(jīng)氣管與球囊間的間隙進入下呼吸道是VAP的重要危險因素[93]。氣管導管從理論上講，應該可以達到封閉氣管導管，杜絕聲門下的滯留物進入下呼吸道同時又不影響氣管粘膜血液供應的要求[80]。但事實上，即使是氣管導管的套囊充氣壓力足夠大也避免不了這種移行，最重要的是這種移行和VAP之間的密切聯(lián)系已經(jīng)被試驗所證實[94]。Rello等[80]經(jīng)多因素分析發(fā)現(xiàn)聲門下分泌物引流失敗和氣管導管囊內(nèi)壓 < 20 cmH2O是VAP的獨立危險因素。對氣囊上滯留物的持續(xù)吸引可以有效的降低早期VAP的發(fā)生，但對病人的死亡率、入住ICU的時間、機械通氣的時間沒有影響[95]?？紤]到這種持續(xù)的吸引可能會造成呼吸道粘膜的損傷，有學者就提出間斷吸引的方法。一項多中心研究對機械通氣48小時以上的氣管插管患者每間隔一小時吸引聲門下分泌物一次，發(fā)現(xiàn)同對照組相比，這種間斷的聲門下吸引使VAP的發(fā)生率從25.6%下降到14.8%[96]。

2.4 氣管導管內(nèi)細菌生物被膜形成

細菌生物被膜或稱為菌膜，是細菌為適應自然環(huán)境，在生長過程中不可逆地附著于固體表面而形成的特殊存在形式[97-98]。細菌吸附于惰性物體如氣管導管或機體黏膜表面后，在生長過程中分泌大量的胞外多糖。胞外多糖可黏結單個細菌形成細菌團塊，大量微菌落使細菌生物被膜加厚。成熟的細菌生物被膜形成高度有組織的結構，該結構具有不均質(zhì)性。其水份含量高達97%，既含有蛋白質(zhì)、多糖等生物大分子物質(zhì)，還含有細菌分泌的營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物及細菌裂解產(chǎn)物。細菌生物被膜的這種特殊結構堅實穩(wěn)定，大大提高了其存活能力，細菌耐藥性增強[99]。機械通氣時氣管導管內(nèi)的氣體和液體流動，吸痰時吸痰管機械碰撞可導致細菌生物被膜移動、堆積或脫落，使這種含有大量細菌的生物被膜碎片向氣管內(nèi)播散，是引發(fā)VAP反復發(fā)生和難治的重要原因之一。對20例病人的24根氣管導管內(nèi)的生物被膜進行細菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，部分被膜沒有菌落生長，部分被膜菌落數(shù)量高達2.1×108 cfu cm-2；提取菌落DNA行梯度凝膠電泳分析檢測到的細菌種類從3種到22種不等[100]，說明氣管導管細菌生物被膜的成分在不同的病人之間存在較大的差異，被膜中細菌種類繁多。抗菌氣管導管（表面包被磺胺嘧啶銀和洗必泰）的應用雖可顯著減少氣管導管內(nèi)、呼吸機環(huán)路內(nèi)及氣管內(nèi)的細菌定植[101]，但可供選擇的抗菌藥物有限，藥物的活性位點常與生物材料共價結合，而且導管無法消毒、有效期短。不過近來這方面研究[102]取得了突破性進展，體內(nèi)外實驗證實共價結合于生物材料上的呋喃酮類化合物能減少表皮葡萄球菌和銅綠假單胞菌的黏附、定植及生物被膜形成，且不誘導細菌耐藥，存放時間長，可消毒。2.5 呼吸機環(huán)路及相關設備與VAP

近來研究發(fā)現(xiàn)減少環(huán)路更換不會影響病原微生物在環(huán)路中的定植。Craven 等研究[103]發(fā)現(xiàn)，同每48小時更換一次呼吸機回路相比，每24小時更換一次呼吸機回路增加了呼吸機相關肺炎的危險性。隨后很多研究致力于探索延長更換呼吸機回路對VAP的影響，很多研究發(fā)現(xiàn)，延長更換呼吸機回路的時間間隔跟頻繁的更換回路相比，并不增加VAP的發(fā)生率[104-105]，甚至最近有研究發(fā)現(xiàn)延長更換回路的時間間隔，同頻繁的更換回路相比VAP發(fā)生率更低[106]。因此，以往認為呼吸機環(huán)路污染與VAP密切相關[107]，要求呼吸機環(huán)路至少每天更換一次的建議是不正確的。

濕化器是環(huán)路中的重要部件，濕化器分兩種：主動濕化器（驅(qū)動吸入氣體先經(jīng)過加熱的水浴器）和被動濕化器（人工鼻，熱、濕交換器）。Kirton等[108]通過隨機對照研究發(fā)現(xiàn)被動濕化器組VAP的發(fā)生率為6.4%，而主動濕化器組為15.7%，其可能原因是被動濕化器具不僅具有過濾作用，而且環(huán)路內(nèi)相對干燥。但近期的一項多中心研究[109]發(fā)現(xiàn)兩組VAP的發(fā)生率并無差異。Thomachot等[110]研究不同更換頻率對VAP的影響，結果每7 d更換組和每24 h更換組的VAP發(fā)生率分別是9.9%和26.2%，因此濕化器同樣無需每天更換。

有效預防VAP的發(fā)生，對于降低VAP的發(fā)病率和病死率，減少住院時間和醫(yī)療費用，具有重要的意義。隨著VAP危險因素的逐步清楚和發(fā)病機制的逐漸闡明，為今后預防VAP的發(fā)生提供了研究基礎。關于VAP的諸多預防策略的有效性存在一定爭議，尚需進一步進行臨床多中心前瞻性隨機雙盲對照試驗來驗證和評價目前的VAP預防措施，進一步探討VAP的發(fā)病機制，制定出一套合理規(guī)范的預防方案。

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