王曉鴻 孟曉軍 鄭燕璇 曹婉維

人體活檢穿刺組織、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織熒光制片、HE制片中的技術(shù)改進(jìn)

王曉鴻 孟曉軍 鄭燕璇 曹婉維

目的人體活體行肺、肝、腎穿刺及實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的肺、肝、腎組織制作免疫熒光切片、石蠟HE切片，用以明確疾病的性質(zhì)以及做科研時(shí)動(dòng)物試驗(yàn)的組織進(jìn)行科學(xué)病理分析。方法我院患者的活檢組織標(biāo)本、試驗(yàn)室的動(dòng)物組織標(biāo)本取1/4及1/3用普通膠水代替OCT包埋劑，冰凍機(jī)下行冰凍切片用以制作直接免疫熒光染色。剩余標(biāo)本組織在脫水機(jī)改進(jìn)時(shí)間后進(jìn)行脫水處理，行石蠟包埋切片做HE染色。結(jié)果組織熒光制片效果好，無(wú)背景著色，切片完整，組織結(jié)構(gòu)清晰。組織石蠟HE切片染色胞漿分明，切片完整。兩種制片鏡下觀察定位準(zhǔn)確。結(jié)論采用改進(jìn)后方法制片，節(jié)約資金，制片的陽(yáng)性強(qiáng)度及陽(yáng)性檢出率與未改進(jìn)前相比效果好，定位準(zhǔn)確。

活檢穿刺組織;實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物組織;膠水包埋;冰凍切片;石蠟標(biāo)本常規(guī)脫水處理的改進(jìn);直接免疫熒光染色;HE染色

隨著醫(yī)學(xué)科技的進(jìn)步及科研方法的需要，在CT、B超引導(dǎo)下行肺、肝、腎穿刺，進(jìn)行病理檢查，以明確疾病性質(zhì)以及做科研時(shí)動(dòng)物試驗(yàn)的組織標(biāo)本進(jìn)行病理分析，這些都需要應(yīng)用病理技術(shù)來(lái)處理以上各種組織進(jìn)行直接免疫熒光染色及石蠟切片的HE染色等等。熒光染色、石蠟切片HE染色的質(zhì)量直接影響到對(duì)患者診斷的判斷及科研工作的成敗。由于活檢肝、腎、肺穿刺組織及試驗(yàn)用動(dòng)物組織標(biāo)本珍貴，組織小、質(zhì)地稚嫩、柔軟、易碎等特點(diǎn)，如果按著常規(guī)標(biāo)本的處理方法，往往容易造成組織過(guò)度收縮、脆裂、失去柔韌性，切片時(shí)呈碎渣樣，不能完整制片，甚至無(wú)法制片［1］。直接熒光免疫染色主要觀察各組織在某種疾病中的變態(tài)反應(yīng)及其病因、發(fā)病機(jī)制，所以在標(biāo)本中顯示的抗原或抗體是很關(guān)鍵的，我們使用冰凍切片行熒光抗體抗原染色。要制作優(yōu)良的熒光切片，各環(huán)節(jié)都非常重要。首先冰凍制片中包埋劑的使用很關(guān)鍵，包埋劑包埋組織(-20℃ ～-25℃)冷凍后對(duì)組織起到支托固定的作用，常規(guī)制作冰凍切片使用的包埋劑是OCT，在多年的臨床工作中，我科使用普通膠水代替OCT包埋，所制冰凍切片用于熒光染色與使用OCT包埋劑所制熒光切片效果相同，現(xiàn)將摸索出的小組織制片方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 所有穿刺組織均為中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院患者的穿刺組織、動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物組織為我院中心試驗(yàn)室科研用動(dòng)物;普通膠水;冰凍切片機(jī)(-20℃ ～-25℃);熒光抗體;PBS沖洗液;全封閉式脫水機(jī);石蠟包埋前組織固定、脫水、透明、浸蠟用的各種試劑。

1.2 方法

1.2.1 制作直接免疫熒光染色［2］將組織置于冰凍機(jī)中用普通膠水包埋［3］，在-20℃ ～-25℃溫度中組織迅速凝凍固定。取下托架后置于冰凍機(jī)冷凍頭上(冷凍頭設(shè)定溫度為-15℃左右)，開(kāi)始修切組織至合適時(shí)留片，切片要求盡量薄切，以利抗原抗體接觸和鏡檢。取出切片用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干固定，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩去PBS加熒光抗體30 ul，置于37℃溫箱孵育18～30 min取出，PBS沖洗3次，每次3分鐘，甩去PBS，緩沖甘油封片避光保存，熒光鏡下觀察。

1.2.2 熒光制片取材后剩余標(biāo)本組織做HE染色［4］①標(biāo)本立即置于中性緩沖甲醛固定液中固定，如果標(biāo)本過(guò)小，可先點(diǎn)上伊紅用擦鏡紙包起來(lái)放進(jìn)固定液中固定，可防組織丟失。固定液要保持新鮮，液量要求充足，固定時(shí)間為1～12 h;②脫水處理［5］:85%乙醇50 min→90%乙醇50 min→95%乙醇Ⅰ90 min→95%乙醇Ⅱ90 min→無(wú)水乙醇Ⅰ90 min→無(wú)水乙醇Ⅱ90 min;③二甲苯透明處理:二甲苯Ⅰ15 min，二甲苯Ⅱ25 min;④浸蠟處理:石蠟Ⅰ120 min，石蠟Ⅱ50 min，石蠟Ⅲ90 min;⑤包埋;⑥切片、烤片、HE染色。

2 結(jié)果

用膠水包埋的組織作冰凍切片凝凍迅速，切片時(shí)質(zhì)感均勻，切片完整，留片后膠水在玻片上容易用水洗凈，同時(shí)組織不易脫落，直接免疫熒光著色清晰，無(wú)背景著色，熒光陽(yáng)性強(qiáng)度及陽(yáng)性檢出率與用OCT包埋的冰凍制片著色的熒光切片相比較，效果無(wú)差異。同時(shí)進(jìn)行石蠟制片的組織經(jīng)過(guò)脫水處理改進(jìn)后，制片可保證組織完整，最大限度保持了組織的結(jié)構(gòu)，無(wú)碎裂，無(wú)過(guò)度收縮、變硬、變脆等現(xiàn)象，可制成3 um以下的超薄切片。鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)好，細(xì)胞染色鮮艷，核漿分明。各種染色均能準(zhǔn)確表達(dá)，同常規(guī)處理的標(biāo)本效果無(wú)異。

3 討論

固定液要求新配制的緩沖中性甲醛固定液，它對(duì)細(xì)嫩的組織固定時(shí)不會(huì)引起強(qiáng)烈的收縮，固定作用較溫和，對(duì)抗原保存較好，最大限度的保持了組織原有的結(jié)構(gòu)，固定效果好，組織在做各種染色時(shí)易著色。脫水時(shí)各梯度酒精穿透力強(qiáng)，脫水速度快，對(duì)細(xì)嫩組織有明顯的收縮作用，應(yīng)嚴(yán)格控制脫水時(shí)間。但是，脫水時(shí)間不夠，會(huì)造成因脫水不足致使二甲苯無(wú)法置換組織中殘留的水份，造成石蠟無(wú)法侵入，形成組織標(biāo)本過(guò)軟，甚至自溶，無(wú)法切片。我們?cè)谠囼?yàn)中還觀察到，即使脫水很好，二甲苯中透明和石蠟浸潤(rùn)過(guò)程中，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可使組織變硬、變脆，失去韌性，無(wú)法制片，影響鏡下判斷。通過(guò)試驗(yàn)，把二甲苯透明總的時(shí)間控制為不超過(guò)40 min，石蠟浸潤(rùn)總的時(shí)間不超過(guò)160 min，制出的切片為優(yōu)質(zhì)切片。制作熒光切片，免疫熒光中的標(biāo)本組織的抗原鑒定和定位直接影響的結(jié)果判斷與對(duì)疾病的診斷，制片中力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性，也不擴(kuò)散至鄰近細(xì)胞或組織間隙中去。冰凍切片作熒光染色原理是用物理的方法低溫冰凍被包埋劑包埋的組織塊后再切片制片，包埋劑本身與組織不會(huì)有任何化學(xué)反應(yīng)，包埋劑(膠水)不會(huì)破壞抗原的完整性，不會(huì)引起抗原發(fā)生溶解和變性、丟失。質(zhì)量好的包埋劑凝凍時(shí)間短，切片時(shí)均勻，易切、易展、易用清水洗去殘留包埋劑。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，認(rèn)為普通膠水代替OCT包埋來(lái)制作冰凍切片，用于直接免疫熒光染色效果與用OCT所制切片效果相同，且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，為醫(yī)院降低了成本，也保證了質(zhì)量。通過(guò)我科室臨床應(yīng)用，改進(jìn)后的組織脫水時(shí)間及對(duì)包埋劑的選擇的改進(jìn)，效果好，值得向大家推廣。

［1］王曉鴻，林宇靜，等．腎臟穿刺活檢病理標(biāo)本的制作與體會(huì)．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4(29):195．

［2］王泊沄，等．腎活檢標(biāo)本的制作技術(shù)．病理學(xué)技術(shù)，2000:948．

［3］王曉鴻，茍新敏，等．制作冰凍切片對(duì)包埋劑的選擇及應(yīng)用．中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2009，4(36):217．

［4］王曉鴻，肖佐環(huán)，等．肝腎肺穿刺組織及實(shí)驗(yàn)用小白鼠組織石蠟制片的處理及改進(jìn)方法．中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2010，37(19):97．

［5］王泊沄，等．組織切片技術(shù)．病理學(xué)技術(shù)，2000:76．

519000 珠海，中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科