顧冬梅，劉 蔚

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123）

影響免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量的因素分析

顧冬梅1,2，劉 蔚1

（1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州 215123）

免疫組化技術(shù)操作過程中存在很多影響因素，直接影響到免疫組化染色質(zhì)量。要獲得滿意的免疫組化染色結(jié)果，必須采取可行有效的辦法，從而為病理診斷提供可靠依據(jù)。

免疫組織化學(xué)；染色質(zhì)量；影響因素

免疫組織化學(xué)是利用抗原抗體特異性結(jié)合這一原理，從組織細(xì)胞水平進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，對(duì)某些蛋白在組織切片或細(xì)胞標(biāo)本中進(jìn)行原位的定位、定性或定量研究的一種技術(shù)[1]。免疫組織化學(xué)技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中一項(xiàng)不可或缺的研究手段，尤其在臨床病理診斷中發(fā)揮著極其重要的作用，為病理診斷提供有價(jià)值的線索。近年來(lái)，隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，許多疑難腫瘤得到了明確診斷，從而進(jìn)一步提高了病理診斷的準(zhǔn)確性，為疾病的治療和預(yù)后的估計(jì)提供了重要的依據(jù)。分子醫(yī)學(xué)的發(fā)展，將治療性的人源性單克隆抗體引入了臨床，免疫組織化學(xué)技術(shù)已經(jīng)作為一項(xiàng)獨(dú)立的檢測(cè)指標(biāo)用于指導(dǎo)臨床的個(gè)性化治療[2]。良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。但是，由于免疫組化技術(shù)操作的影響因素眾多，常常導(dǎo)致免疫組化染色質(zhì)量不穩(wěn)定，影響最終診斷。如何避免和消除這些因素的影響，是我們每一位病理學(xué)工作者都希望解決的問題。對(duì)此，我們總結(jié)以往操作經(jīng)驗(yàn)，歸納分析影響免疫組化染色質(zhì)量的各種因素，旨在提高染色質(zhì)量，獲得滿意的免疫組化染色結(jié)果。

企業(yè)最重要的發(fā)展戰(zhàn)略就是對(duì)企業(yè)內(nèi)部各個(gè)環(huán)節(jié)的管理控制，在服裝制造的各個(gè)過程中要加強(qiáng)監(jiān)管力度，保障各個(gè)階段的生產(chǎn)制造過程都盡量零失誤，使得企業(yè)在產(chǎn)品的質(zhì)量上有保障。此外，企業(yè)要積極的響應(yīng)“一帶一路”的發(fā)展戰(zhàn)略，利用國(guó)家的優(yōu)勢(shì)發(fā)展，促進(jìn)企業(yè)的品牌提升。

1 組織處理的影響因素

1.1 組織的取材、脫水及浸蠟 恰當(dāng)?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，不僅要求有效防止組織成分的自溶，保持組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的完整性，更需要保持細(xì)胞組織成分的抗原不受彌散或損壞。組織的處理包括組織的及時(shí)取材、固定和適宜的石蠟包埋處理。

——寧夏的一名高考落榜生被哈佛大學(xué)錄取，并給予全額獎(jiǎng)學(xué)金。這位姓楊的學(xué)生花了很多精力建立一個(gè)非政府公益組織，支援西部教育。哈佛方面對(duì)此作出如是解釋。

取材是組織處理的第一步，免疫組化的取材特別強(qiáng)調(diào)及時(shí)，同時(shí)要注意：工具要銳利，切忌反復(fù)切拉組織造成局部組織的擠壓、壞死；組織塊大小要適中，理想的取材大小為0.2cm× 1cm×1cm，這樣既能使固定劑快速有效地滲透到組織內(nèi)部，使其充分地固定，也有利于脫水和浸蠟，又能防止組織的脫片。組織在脫水機(jī)中的處理?xiàng)l件應(yīng)十分妥當(dāng)，大量的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，在加熱抗原修復(fù)過程中組織脫片的主要原因是取材過厚和脫水浸蠟處理不當(dāng)所致。免疫組化要求組織脫水透明要夠而不過，浸蠟的溫度不宜超過58℃，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成組織收縮和透明過度，其結(jié)果是組織切片困難，染色過程也極易脫片，且染色效果不好，如果HE切片尚做不出滿意的染色結(jié)果，那么根本無(wú)法保證免疫組化的染色質(zhì)量。

近年來(lái)，泥石流災(zāi)害研究已經(jīng)成為了全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題，由于世界各國(guó)的自然地理?xiàng)l件和經(jīng)濟(jì)發(fā)展情況的差異，呈現(xiàn)出不同的研究方法與技術(shù)手段，并且在研究對(duì)象的選擇上也大不相同，但是隨著互聯(lián)網(wǎng)的普及，各地區(qū)泥石流領(lǐng)域的研究與交流日益加深，泥石流研究的基本方法和觀念等趨于統(tǒng)一。就我國(guó)而言，針對(duì)泥石流的相關(guān)研究起步相對(duì)較晚，以致于對(duì)泥石流的理論研究和實(shí)際觀測(cè)趨于同步展開。

2.1 抗原修復(fù)及染色操作 在免疫組化染色中，抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果極其重要的因素。所謂抗原修復(fù)，即破壞組織固定時(shí)分子間所形成的交聯(lián)，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。大量實(shí)踐證明，加熱抗原修復(fù)處理后的免疫組化染色敏感度大幅度地提高，因此得到了廣泛的使用，為大多數(shù)抗體染色修復(fù)時(shí)所選用。而熱修復(fù)中強(qiáng)力推薦使用高溫高壓抗原修復(fù)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高壓法的實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性與染色強(qiáng)度均優(yōu)于其他熱修復(fù)法（水浴法及微波法）。加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種，目前首選為0.01%檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰，適合于大多數(shù)抗體[4]。但部分難于表達(dá)的抗體應(yīng)選擇EDTA和Tris抗原修復(fù)效果較強(qiáng)的緩沖修復(fù)液為宜。

1.2 組織的固定 組織固定要及時(shí)充分。在眾多的組織固定液中，如甲醛、乙醇、戊二醛、B5等等這些不同種類固定液在不同實(shí)驗(yàn)方法（如PCR、電鏡、免疫組化、分子雜交等）的使用中各有千秋。但在保持組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性、抗原可測(cè)定性、組織滲透性以及試劑的價(jià)格上，福爾馬林都是首選。而在免疫組化染色中，固定劑首推的是10%中性福爾馬林，福爾馬林固定引起的組織抗原決定簇的交聯(lián)與封閉可以通過抗原修復(fù)方法來(lái)修正[3]。為確保離體組織的抗原性，必須在手術(shù)后的15min內(nèi)馬上固定，組織須浸沒于固定液中，對(duì)于絕大部分組織，在常溫條件下固定8-24h最佳。

通常免疫組化染色采用的是辣根過氧化物酶系統(tǒng)，其檢測(cè)方法簡(jiǎn)便易行，試劑穩(wěn)定。因此顯色劑首選的是DAB，其配制方法簡(jiǎn)單，在組織切片上定位比較清晰，染色結(jié)果非常容易保存。DAB顯色時(shí)間以及DAB顯色劑的濃度對(duì)免疫組化的染色結(jié)果有很大影響，濃度過高、時(shí)間過長(zhǎng)均會(huì)造成染色結(jié)果太深而影響觀測(cè)甚至造成假陽(yáng)性，因此DAB應(yīng)遵循說(shuō)明書濃度現(xiàn)配現(xiàn)用，時(shí)間控制以在鏡下為佳，顯色以在2-10min內(nèi)為宜。最后用蘇木素復(fù)染后應(yīng)讓流水徹底沖洗切片，再浸入溫水使其充分藍(lán)化，這樣DAB染色與背景襯染對(duì)照效果較好，有利于免疫組化染色結(jié)果的觀測(cè)。

2 染色過程和結(jié)果判讀的影響因素

1.3 組織的防脫片、切片、烘片及脫蠟 玻片的處理是做好免疫組化染色的重要步驟，尤其需要微波或高壓等抗原修復(fù)的標(biāo)本極易造成脫片，其玻片的處理就格外重要，應(yīng)選用多聚左旋賴氨酸或APES等粘附劑對(duì)載玻片進(jìn)行處理。在日常工作中，我們選用APES對(duì)載玻片進(jìn)行處理，將玻片放入1：50比例丙酮稀釋的APES中，停留20-30秒，取出稍停，再入純丙酮涮去未結(jié)合的APES，晾干后使用，可取得極好的防脫片效果。另外，免疫組化切片要求平整、無(wú)皺褶、無(wú)刀痕，因?yàn)榘欛?、刀痕處可出現(xiàn)假陽(yáng)性，切片厚度一般要求為3-4um，要盡可能地薄。實(shí)踐證明，越是薄而平的切片，越不易脫片。切片在56℃-60℃恒溫箱里應(yīng)充分烘烤，至少烘片1小時(shí)才不至于脫片，但溫度過高或時(shí)間過長(zhǎng)抗原容易丟失，故實(shí)際工作中，我們把組織切片置于58℃-60℃的恒溫箱中烘烤1-2小時(shí)或37℃恒溫箱中過夜，可使切片牢固而防脫片。

在免疫組化染色中若采用過氧化物酶的檢測(cè)系統(tǒng)，必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶封閉處理。如果不進(jìn)行處理，組織中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞會(huì)干擾染色結(jié)果的判斷。一般采用較緩和的方法：0.3% H2O2進(jìn)行封閉處理，對(duì)染色結(jié)果沒有影響。染色過程中采用的沖洗緩沖液為PBS（pH7.2-pH7.4），加入適量的Tween20可增強(qiáng)沖洗效果。若沖洗不充分，會(huì)出現(xiàn)非特異性背景染色，故實(shí)際操作中應(yīng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)沖洗步驟。

第一抗體是免疫組化中最重要的試劑。目前市售的抗體有兩種：濃縮型抗體和即用型抗體。濃縮型抗體可小量分裝凍存（但應(yīng)避免反復(fù)凍融而影響效價(jià)），應(yīng)用前要在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行成倍數(shù)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)找出最佳稀釋度，也就是最佳的抗體染色和最低的背景著色，還應(yīng)遵循現(xiàn)用現(xiàn)配的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用，最好應(yīng)用專門的抗體稀釋液來(lái)稀釋抗體。即用型抗體可直接使用，一般4℃保存有效期為24個(gè)月，操作方便，比較適合日常工作使用。合適的孵育時(shí)間也是保證良好染色結(jié)果的重要因素。大部分一抗的孵育時(shí)間為37℃條件下1h，或4℃冰箱過夜最為合適。

免疫組化染色的脫蠟步驟與常規(guī)HE脫蠟步驟相同，但免疫組化脫蠟需完全干凈，最佳方法是與常規(guī)脫蠟分開以保證脫蠟徹底，否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。

圖5顯示的是不同電源電壓下基準(zhǔn)電壓隨溫度的變化。由仿真結(jié)果可知，1.2 V電源電壓下，在-40～110℃的溫度范圍內(nèi)，基準(zhǔn)電壓的溫漂系數(shù)為24 ppm/℃；常溫下，在0.9～2 V電源電壓范圍內(nèi)，基準(zhǔn)電壓的電源電壓調(diào)整率為0.48%/V。

2.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)照及結(jié)果判斷 要準(zhǔn)確判斷免疫組化染色是否成功，必須在染色過程中設(shè)立陰性及陽(yáng)性對(duì)照。陰性對(duì)照：選擇組織中無(wú)待測(cè)抗原，加載一抗后，觀察與一抗有無(wú)交叉反應(yīng)。陽(yáng)性對(duì)照：選擇組織中含有待測(cè)抗原，加載一抗后，觀測(cè)與一抗結(jié)合的特異性。在實(shí)驗(yàn)染色中，陰性和陽(yáng)性對(duì)照切片的實(shí)驗(yàn)抗原修復(fù)條件必須與待測(cè)一抗切片的實(shí)驗(yàn)條件完全一致，陰性和陽(yáng)性對(duì)照均取得預(yù)期染色結(jié)果，本次免疫組化染色結(jié)果才是可靠的。

實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果觀察判斷中，真陽(yáng)性與假陽(yáng)性的判定需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，真陽(yáng)性染色結(jié)果應(yīng)表達(dá)在預(yù)期對(duì)應(yīng)的組織結(jié)構(gòu)中，定位清晰準(zhǔn)確；假陽(yáng)性一般出現(xiàn)在非預(yù)期對(duì)應(yīng)的組織中。個(gè)別抗體偶爾出現(xiàn)定位異常，如CD20（L26）偶爾見核表達(dá)[5]，部分淋巴瘤中可以出現(xiàn)上皮膜抗原（EMA）的表達(dá)，均是可以的。

3 結(jié)語(yǔ)

綜上所述，影響免疫組化染色質(zhì)量的因素及環(huán)節(jié)眾多。正確認(rèn)識(shí)及分析這些因素，才能盡可能消除和避免這些因素對(duì)免疫組化染色質(zhì)量的影響，如采用10%中性福爾馬林固定液固定組織，使用高溫高壓抗原修復(fù)方法及適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)液，選擇合格的免疫組化試劑及恰當(dāng)?shù)娜旧椒?，設(shè)立正確的實(shí)驗(yàn)對(duì)照，并嚴(yán)格按照操作規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，才能獲得令人滿意的免疫組化染色結(jié)果，使免疫組化技術(shù)真正成為精確可靠的臨床病理輔助診斷手段。

[1]許良中.實(shí)用腫瘤病理方法學(xué)[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997.

[2]Tarlor C R.The total test approach to standardization of im munohistochemistry[J].Arch Pathol Lab Med,2000,124:945 -951.

[3]Battifora H,KopinskiM.The influence of protease digestion and duration of fixation on the immuno-staining ofkeratins:a comparison of formalin and ethanol fixation[J].The Jou-rnal ofHistochemistry and Cytochemistry,1986,34:1095-1100.

[4]Elias J,Margiotta M.Low temperature antigen restoration of steroid hormone receptor roteins in routine paraffin sections [J].Histotechnol,1997,20(2):155-158.

[5]紀(jì)小龍,施作霖.診斷免疫組織化學(xué)[M].北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社,1997.

Factor’s Analysison Influencing the Staining Qualitiesof Immunohistochem istry

GU Dong-mei，LIUWei
(DepartmentofPathology，TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，SuzhouJiangsu215006，China)

There are various influencing factors in operating technicalskillof immunohistochem istry，which directly affectstaining qualitiesof immunohistochem istry.Practicable and effectivemethodsmustbe taken to obtain the satisfied results of immunohistochem istry and thus provide reliable evidence for the pathologicaldiagnosis.

immunohistochem istry；staining quality；influencing factor

R446

A

1671-0142（2011）06-0066-03

顧冬梅（1977-）,女,江蘇蘇州人,主管技師,在讀碩士研究生,研究方向?yàn)椴±砼c病理生理學(xué).

（責(zé)任編輯 劉 紅）