龍成美 王金根 李新長

MSI和MMP-9檢測在膀胱上皮細胞癌的臨床意義

龍成美 王金根 李新長

目的探討微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)和基質金屬蛋白酶9(MMP-9)在膀胱上皮細胞癌(UCC)中的表達及其與腫瘤臨床分期、病理分級、術后復發(fā)轉移及預后的關系。方法選擇4個微衛(wèi)星位點應用PCR方法檢測44例UCC和10例正常膀胱組織的MSI，并采用免疫組化(SP法)檢測MMP-9的表達。結果44例UCC中MSI表達率為77.3%，強陽性表達率為45.5%，MMP9陽性表達率為61.4%，強陽性表達率為38.6%。MSI和MMP9的強陽性表達率隨分級分期增高而增高(P＜0.05)，復發(fā)組兩者強陽性率高于新發(fā)組(P＜0.05)，UCC中MSI與MMP-9強陽性表達組的術后復發(fā)率高于弱陽性表達組(P＜0.05)，術后生存率低于弱陽性表達組(P＜0.05)。兩者同時表達強陽性組的術后復發(fā)轉移率高于單個強陽性表達組(P＜0.05)，術后生存率低于單個強陽性表達組 (P＜0.05)。MSI和MMP9在10例正常膀胱組織中均呈陰性表達。結論MSI及MMP-9的表達與UCC的臨床分期、病理分級、復發(fā)轉移密切相關，在膀胱上皮細胞癌診斷和術后隨訪中有重要意義。

MSI;MMP-9;膀胱上皮細胞癌;復發(fā)腫瘤轉移

膀胱上皮細胞癌(urothelial cell carcinoma，UCC)是常見泌尿系惡性腫瘤之一。早期研究認為膀胱癌的發(fā)生與微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)有關，近年來研究表明蛋白水解酶9(metalloproteinase-9，MMP-9)與 UCC的浸潤、復發(fā)、轉移有關［1-4］。本文通過研究UCC組織中 MSI和MMP-9的表達與臨床分期、病理分級、及術后復發(fā)轉移及預后的關系，找尋膀胱腫瘤早期診斷和監(jiān)測復發(fā)的簡單有效方法，并為臨床治療隨訪提供依據(jù)。

資料和方法

1.一般資料:本組44例UCC腫瘤組織、外周血標本均來自江西省人民醫(yī)院2008年1月至2010年12月住院患者，經膀胱鏡活檢或術后病理證實為UCC，患者年齡從38～78歲，平均62歲，其中男性40例，女性4例。臨床分期按TNM分期，病理分級按WHO標準確定，GⅠ8例，GⅡ12例，GⅢ24例，Ta-T1期24例，T2-T4期20例，新發(fā)35例，復發(fā)9例。－80℃深低溫冰霜保存腫瘤標本;同時留取患者外周靜脈血4 ml加EDTA抗凝液，編號保存于深低溫冰霜。正常膀胱組織10例，分別來自良性前列腺增生癥、膀胱憩室、尿石癥、尿道狹窄。本組44例均獲得長期臨床隨訪。

2.主要試劑和方法

(1)PCR方法檢測MSI:標本經蛋白酶K消化后，采用經典的酚-氯仿-異戊醇抽提法稍加改進提取DNA，PCR擴增，電泳，電泳結束后在紫外透射下觀察，選取中國人UCC最易發(fā)生微衛(wèi)星改變的4個位點:D9S54、D9S162、D9S747、IFN-A1，引物序列查自http://www.gdb.com，由上海長城生物公司合成。以DL-2000Marker做標準對照，結果予照相并進行分析。

(2)免疫組化SP法檢測MMP-9:每例石蠟標本均以4μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓修復抗原，嚴格按試劑盒說明書染色，封片后鏡檢。MMP-9以已知陽性乳腺癌組織作為陽性對照，以PBS緩沖液替代一抗作為陰性對照。鼠抗人MMP-9單克隆抗體和SP超敏試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

3.結果判定標準:MSI:以外周血淋巴細胞DNA的PCR擴增產物作為正常對照，與膀胱腫瘤標本的擴增產物在相鄰的條帶上于同一條件下進行電泳，若腫瘤組織的條帶與正常相比出現(xiàn)額外條帶或等位基因電泳條帶的位置改變即判定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定，以出現(xiàn)2個或2個以上位點MSI記為MSI強陽性，0～1個位點MSI記為MSI弱陽性。MMP-9:隨機觀察計數(shù)10個高倍鏡(×400)視野下的陽性細胞。MMP-9陽性為細胞質內存在淺黃色至棕黃色顆粒，以陽性細胞百分率＜10%為陰性(-)，10%～50%為弱陽性(+)，＞50%為強陽性(++)。

4.實驗分組:根據(jù)臨床及病理特征分組，低分級組(Ⅰ、Ⅱ級，n=20)和高分級組(Ⅲ級，n=24);低分期組(Ta-T1期，n=24)和高分期組(T2-T4期，n=20)，新發(fā)組(n=35)和復發(fā)組(n=9)，MSI強陽性表達組(n=20)和弱陽性表達組(n=24)，MMP-9強陽性表達組(n=17)和弱陽性表達組(n=27)。比較各組間MSI和MMP-9的強陽性表達率是否存在差異，以此分析二者的表達與UCC臨床病理特征及復發(fā)轉移的相關性。

5.統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0軟件包行統(tǒng)計學分析。采用卡方檢驗或Fisher’s精確概率檢驗法分析MSI及MMP-9在不同分組中陽性表達率的差異。以Log-rank法比較不同分組中復發(fā)轉移率的差異。檢驗水準 α=0.05。

結 果

1.MSI和 MMP-9在組織中的表達:MSI和MMP-9在正常對照膀胱組織中均呈陰性表達，44例UCC中 MSI表達率為77.3%，強陽性表達率為45.5%，MMP9陽性表達率為61.4%，強陽性表達率為 38.6%。

2.MSI和MMP-9表達與臨床病理分級的關系:MSI高分期分級組強陽性表達率顯著高于低分期分級組(P＜0.05);復發(fā)組顯著高于新發(fā)組(P＜0.05)。MMP-9高分期組、高分級組、復發(fā)組強陽性表達率顯著高于低分期組、低分級組、新發(fā)組(P＜0.05)。

3.MSI和MMP-9強陽性與預后的關系:術后隨訪顯示MSI、MMP-9強陽性表達組的術后復發(fā)、轉移率高于弱陽性表達組(P＜0.05)，而術后生存率則低于弱陽性表達組(P＜0.05)。兩者同時表達強陽性組的術后復發(fā)轉移率高于單個強陽性表達組(P＜0.05)，術后生存率低于單個強陽性表達組(P ＜0.05)。

討 論

1.MSI在UCC組織中的表達及意義:MSI在膀胱腫瘤的表達及其在作為膀胱腫瘤早期診斷標記物的意義，國內外學者已取得初步成果，研究集中選擇合適的微衛(wèi)星位點對尿液標本進行非侵入性診斷膀胱腫瘤，有的已開發(fā)試用于臨床。Vaish等［1］在評估膀胱癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性時研究發(fā)現(xiàn)，在淺表膀胱腫瘤組83%存在MSI且腫瘤分級高，MSI陽性者27%有肌層浸潤。Amira等［2］研究膀胱腫瘤復發(fā)的非侵襲性分子檢測結果表明，初發(fā)腫瘤MSI陽性率為94%(44/47)，復發(fā)腫瘤 92%(9/12)，并觀察到75%(9/12)MSI檢測腫瘤復發(fā)比膀胱鏡檢查早1～9個月。Molina等［3］選取10個微衛(wèi)星位點檢測UCC發(fā)現(xiàn)72.7%存在MSI，且與腫瘤分級分期相關，MSI陽性患者易出現(xiàn)一次或多次腫瘤復發(fā)。本實驗結果表明，正常對照膀胱組織中MSI表達陰性，而在UCC組織中則多呈強陽性表達，與文獻報道相符。MSI與UCC臨床病理分期分級相關，強陽性表達率隨著臨床分期分級的增高而增加;復發(fā)組強陽性表達率顯著高于初發(fā)組;且有5例比膀胱鏡提前檢出膀胱腫瘤，提示MSI可作為于腫瘤早期診斷和監(jiān)測腫瘤復發(fā)的方法之一，并且MSI檢測可為臨床治療提供思路如早期選擇膀胱全切或放療等。

2.MMP-9在UCC組織中的表達及意義:研究發(fā)現(xiàn)，MMPs可降解細胞外基質(ECM)促進腫瘤的浸潤和轉移［4］。MMP-9是MMPs家族中的重要成員，是水解Ⅳ型膠原的關鍵酶，又稱為明膠酶B。目前認為MMP-9參與腫瘤侵襲和轉移的主要機制是MMP-9能降解Ⅳ型膠原，為腫瘤細胞的擴散性生長去除機械屏障，并介導新生血管的形成;其次，MMP-9可以通過影響細胞與細胞外基質、細胞與細胞的粘附性而增強腫瘤細胞的侵襲力。本實驗結果表明，MMP-9的表達水平與UCC臨床分期、病理分級密切相關，強陽性表達率隨著臨床分期、病理分級的增高而增加;復發(fā)組強陽性表達率顯著高于新發(fā)組;結合臨床隨訪資料進行分析后發(fā)現(xiàn)MMP-9的表達水平與UCC的復發(fā)、轉移及預后密切相關，可作為預測UCC惡性程度及預后的重要指標。

3.MSI和MMP-9在UCC組織中表達的臨床意義:膀胱鏡檢查是診斷和隨訪UCC的金標準。但因膀胱鏡檢查的有創(chuàng)性，患者多不能耐受而失訪，許多研究者一直致力于其它敏感性和特異性高的檢測方法以用于術后診斷和隨訪［5］。本實驗研究MSI和MMP-9在UCC組織中的表達，結果表明兩者在UCC組織中的表達率高，聯(lián)合檢測比單個檢測更有助于判斷預后，在UCC的診斷隨訪檢查中有較大的應用前景。

1 Vaish M，Mandhani A，Mittal RD，et al.Microsatellite instability as prognostic marker in bladder tumors:a clinical significance［J］.BMC Urology，2005，5:2-12.

2 Amira N，Mourah S，Rozet F，et al.Non-invasive molecular detection of bladder cancer recurrence［J］.Cancer，2002，101(3):293-297.

3 Molina Burgos R，Millán Salvador JM，Oltra Soler JS，et al.Microsatellite analysis in exfoliated cells from urinary sediment.Its utility for the detection of bladder cancer.Comparison with urinary cytology［J］.Actas Urol Esp，2003，27(8):618-628.

4 Van de Wiele C，Oltenfreiter R.Imaging probes targeting matrix metalloproteinases［J］.Cancer Biother Radiopharm，2006，21(5):409-417.

5 Quek ML，Sanderson K，Daneshmand S，et al.New molecular marker for bladder cancer detection［J］.Curr Opin Urol，2004，14(5):259-264.

Expressions of MSI and MMP-9 in Urothelial Cell Carcinoma

LONG Cheng-mei，WANG Jingen，LI Xing-chang(Department of Organ Transplantation，Jiangxi Province People’s Hospita，Nanchang 330006，China)

ObjectiveTo explore the expressions of microsatellite instability(MSI)and metalloproteinase-9(MMP-9)in urothelial cell carcinoma(UCC)and to determine their relationship with clinic stages，pathological characters，recurrence metastasis and survival.Methods4 microsatellite markers were selected to detect the expressions of MSI with PCR in 44 tissues of UCC and 10 tissues of normal mucosa of bladder.Immunohistochemistry was used to detect the expressions of MMP-9.ResultsMSI was found in 34 of 44 UCC patients(77.3%)，MMP-9 was in 27 of 44 UCC patients(61.4%)，and the strongly positivity rate of MSI and MMP-9 in UCC were 45.5%and 38.6%;The strongly positive rate of MSI and MMP-9 in UCC closely correlated with higher clinical stages and pathological characters(P ＜0.05)，postoperative recurrence was higher than original group(P ＜0.05).The postoperative follow-up showed that the group of MSI and MMP-9 strongly positive had a higher risk of recurrence/metastasis and a lower survival rate than the group of weakly positive(P ＜0.05)，the rate of both MSI and MMP-9 strongly positive was higher than the rate of MSI or MMP-9 separately strongly positive(P ＜0.05);The group of both MSI and MMP-9 strongly positive had a lower survival rate than the group of MSI or MMP-9 separately strongly positive(P ＜0.05).While in normal controls all were negative.ConclusionsThe expression of MSI and MMP-9 closely correlated with the clinical stage and pathological grade of UCC，and affected the risk of recurrence/metastasis.It was suggested that they may play some role in the prognosis and follow-up of patients with UCC.

MSI;MMP-9;Urothelial cell carcinoma;Recurrence/metastasis

330006 江西省人民醫(yī)院器官移植科