林煦東，李運(yùn)生，張運(yùn)海

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

中國(guó)有著悠久的飲茶歷史，喝茶已經(jīng)成為老百姓生活的重要部分，茶的保健功能已被人們認(rèn)可。近年來，茶葉中有效成分已經(jīng)逐步被分離，并對(duì)其中的一些主要成分進(jìn)行了研究。茶葉里最主要成分是茶多酚(TP)，又名茶單寧、茶轎質(zhì)，是茶葉中含有一類多羥基酚類化合物的總稱，含量約占茶葉干重的20%～30%。茶多酚為白色無(wú)定形粉末，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯以及微溶于油脂，不溶于苯及氯仿等有機(jī)溶劑；在pH2～7時(shí)十分穩(wěn)定，光照或pH＞8時(shí)不穩(wěn)定，易氧化褐變，具有耐熱性、耐酸性和吸濕性[1]。按化學(xué)結(jié)構(gòu)茶多酚可分為黃烷醇類、黃酮(或類黃酮醇類)、花色素類和酚酸(縮酚酸類)4類。黃烷醇類的多種兒茶素(C)是茶多酚中最重要的成分，占TP總量的60%～80%。兒茶素由表兒茶素(EC)、沒食子兒(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食子酸(ECG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)等幾種單體組成[2]。其中含量最高的為EGCG，分子量458.38，分子式為C22H18O11，在室溫和水中穩(wěn)定，并且pH值越低，穩(wěn)定性越好[3]。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)EGCG的抗氧化、抗突變、抗腫瘤以及抗紫外線等[4,6]生物活性進(jìn)行了大量研究，但針對(duì)其在動(dòng)物生殖影響方面的研究較為少見。本文將近幾年EGCG對(duì)動(dòng)物生殖影響的研究進(jìn)行了綜述，以期為EGCG在動(dòng)物生殖方面的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 研究現(xiàn)狀

EGCG是茶多酚中主要的水溶性活性物質(zhì)[7]，因其特殊的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)，使其具有較強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基功能，能夠?qū)?xì)胞起到保護(hù)作用，并阻礙DNA受到損害。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)EGCG的研究報(bào)道主要體現(xiàn)在抗氧化、清除有害自由基、防癌抗癌等生物活性方面。

1.1 EGCG抗氧化性及清除自由基作用

EGCG的基本結(jié)構(gòu)為2-連(或鄰)苯酚基苯并吡喃衍生物，具有較多的羥基，與尚不成對(duì)的氧原子單電子相互作用，發(fā)生共軛效應(yīng)，使不成對(duì)的單電子靠向苯環(huán)，導(dǎo)致氫氧鍵減弱，競(jìng)爭(zhēng)性地與不飽和脂肪酸爭(zhēng)奪活性氧，相互結(jié)合形成穩(wěn)定的二聚體，終止氧化反應(yīng)。因此，EGCG作為抗氧化劑的活性強(qiáng)于一般的非酚類或單酚羥基類抗氧化劑。此外，EGCG是一類氧化還原電位很低的還原劑，具有供氫能力，氫與自由基結(jié)合，使之還原為惰性化合物或較穩(wěn)定的自由基，從而清除機(jī)體內(nèi)過多的有害自由基，因而具有很強(qiáng)的清除自由基的作用[8]。馬森等[9]對(duì)武夷巖茶中茶多酚對(duì)油脂的抗氧化效果進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)中在豬油中分別添加0.4%的VC、VE和武夷巖茶TP，進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)14 d，隔日取樣測(cè)定油脂的過氧化值(POV)和酸價(jià)(AV)。結(jié)果表明，VC和VE分別使油脂的AV升高280%和274%，而TP使油脂AV降低27%。說明TP對(duì)油脂有顯著的抗氧化效果，作用優(yōu)于VC和VE。同時(shí)，Maeda K等[10]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚及其單體對(duì)氧自由基的清除率可達(dá)98%以上，在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，且抗氧化性高于VC和VE等。Devika P T等[11]研究證實(shí)，EGCG可以顯著增強(qiáng)對(duì)機(jī)體的抗氧化能力，減少體內(nèi)過氧化物的生成。此外，Yin S T等[12]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠逆轉(zhuǎn)由鉛引起的海馬細(xì)胞過氧化損傷，保持體內(nèi)氧化與抗氧化平衡狀態(tài)。因此，可以作為一種潛在的重金屬慢性中毒的輔助治療劑。羅一帆等[13]應(yīng)用化學(xué)發(fā)光方法研究了4種兒茶素及其組合物對(duì)超氧陰離子自由基(O·2-)和羥自由基(OH·)的清除能力，并對(duì)其之間的清除能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，4種兒茶素的濃度相同時(shí)，其O·2-和OH·清除率的大小順序?yàn)椋篍GCG＞ECG＞EGC＞EC?？梢?EGCG對(duì)自由基清除率影響是最顯著的。

1.2 對(duì)EGCG在防癌抗癌方面的研究

癌癥是人類的第一殺手，如何預(yù)防和治療癌癥已經(jīng)成為現(xiàn)在人類亟待解決的問題。有學(xué)者研究證明EGCG能抑制癌細(xì)胞生存所需的信號(hào)傳遞[14,15]，降低多種酶的活性，與一些抗氧化劑相互作用降低某些致癌物質(zhì)的活性、清除有害自由基[16]、減輕對(duì)心臟的毒性[17]。此外，由于EGCG是腫瘤耐藥性的逆轉(zhuǎn)劑，能夠提高癌細(xì)胞對(duì)化療的敏感性[18]。近幾年對(duì)EGCG抗結(jié)腸癌的影響研究比較深入，Larsen C A等[19]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行磷酸化過程，從而抑制腫瘤組織血管再生以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移。Masahito S等[20]研究表明EGCG能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，主要是通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)因子及受體，增強(qiáng)該受體結(jié)合蛋白的表達(dá)。此外,EGCG對(duì)乳腺癌、肝癌、肺癌等都有較強(qiáng)的抑制作用。Dale GN等[21]研究了綠茶多酚對(duì)人乳頭狀瘤病毒的治療作用。在接受EGCG單體或去咖啡因綠茶兒茶素混合物制劑治療的病人，50%左右的病人有顯著的反應(yīng)，而且?guī)缀鯖]有副作用，起到預(yù)防和治療癌癥的作用。Nishikawa等[22]研究發(fā)現(xiàn)EGCG能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，對(duì)肝癌起到抑制作用。同時(shí)Rieko Y等[23]研究證實(shí)EGCG也能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，對(duì)肺癌起到抑制作用。魯藜[24]研究表明EGCG與化學(xué)藥品苯甲基-α-N-乙酰半乳糖胺類似的去糖基化作用和抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了其抗腫瘤作用。

2 EGCG對(duì)哺乳動(dòng)物生殖的影響

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)EGCG的研究報(bào)道多集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是在抗氧化、清除自由基、防癌抗癌中的作用，但甚少報(bào)道其在哺乳動(dòng)物生殖方面的影響。EGCG作為天然、無(wú)毒性抗氧化劑，如何提高卵母細(xì)胞的成熟率和受精率是一個(gè)值得探討的問題。

2.1 EGCG對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞體外發(fā)育的影響

由于卵母細(xì)胞或胚胎的體外成熟培養(yǎng)時(shí)，其抗氧化性比體內(nèi)低，因此卵母細(xì)胞或胚胎離開供體后不能得到母體抗氧化劑的保護(hù)，所以在體外培養(yǎng)時(shí)添加抗氧化劑以提高體外培養(yǎng)的效果。Wang等[25]研究了綠茶多酚對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)、體外受精(IVF)、細(xì)胞內(nèi)的谷光甘肽(GSH)濃度和胚胎發(fā)育的影響。添加15、20、25μmoL的綠茶多酚，在添加量為15μmoL時(shí)成熟卵母細(xì)胞內(nèi)的GSH分泌量最高(P＜0.05)，而在添加量為20或25μmoL時(shí)較低(P＜0.05)。結(jié)果表明，在體外成熟時(shí)添加適當(dāng)濃度的綠茶多酚(15μmoL)對(duì)后期的胚胎發(fā)育有益，而且與牛卵母細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽濃度相關(guān)，過高或過低均不利于卵母細(xì)胞成熟和胚胎的發(fā)育。谷亞輕等[26]研究了EGCG對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟的影響。在裸卵(DO)和包裹顆粒細(xì)胞3層及以上的小鼠卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)體系中分別添加0、10、15、20、25μmoL濃度的EGCG，培養(yǎng)16 h后觀察結(jié)果，10μmoL和15μmoL濃度添加組與不添加組之間結(jié)果差異不顯著，20μmoL添加組與各組間差異顯著，效果最好。25μmol添加組與各組間也表現(xiàn)為差異顯著，但效果最差。結(jié)果表明在小鼠卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液(TCM-199體系)中，培養(yǎng)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)時(shí)EGCG的最佳添加量20μmoL，可以顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率。ZRoth等[27]研究了體外注射EGCG后，熱應(yīng)激對(duì)小鼠胚胎體內(nèi)發(fā)育的影響，結(jié)果表明EGCG對(duì)母體熱應(yīng)激引起的卵母細(xì)胞破壞具有一定的保護(hù)作用，對(duì)小鼠胚胎體內(nèi)發(fā)育有促進(jìn)作用。鄒恒等[28]研究對(duì)EGCG用于小鼠卵母細(xì)胞體外成熟的試驗(yàn)，在COCs和DO的小鼠卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)體系中分別添加0、10、15、20、25μmoL濃度的EGCG，結(jié)果表明在小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)體系中添加濃度為20μmol的EGCG時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有顯著促進(jìn)作用，添加濃度為25μmol的EGCG時(shí)則有顯著抑制作用。尚麗青等[29]研究了添加15μmol/L的EGCG時(shí)對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟表現(xiàn)出了明顯的促進(jìn)作用，降低了卵母細(xì)胞中谷光甘肽氧化速度。Mor teza Yavar i等[30]研究了添加EGCG對(duì)豬的卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，在豬胚胎的體外培養(yǎng)環(huán)境中添加0、1、5、10、50μmol/L濃度的EGCG，研究表明添加量為0μmol/L和1μmol/L時(shí)，豬的卵裂率、囊胚率、DNA片段化、凋亡均無(wú)差異，添加量為10μmol/L和50μmol/L時(shí)，影響了豬卵母細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致胚胎死亡。同時(shí)Spinaci等[31]也證實(shí)了在添加0、5、10、15、20、25μg/mL的EGCG，對(duì)豬卵母細(xì)胞IVM和IVF的發(fā)育均無(wú)影響，在25μg/mL的劑量下，孤雌激活后發(fā)育到囊胚的數(shù)量顯著下降，其他無(wú)差異。

2.2 EGCG對(duì)哺乳動(dòng)物精子的影響

EGCG能消除體內(nèi)自由基，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率達(dá)98%，對(duì)自由羥基的清除率達(dá)99.3%～99.97%[32]。因此其能夠提高體內(nèi)自由基消除酶的活性，進(jìn)而減少了由此所致的DNA損傷。Spinaci等[31]在體外進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),在豬體外受精過程中添加EGCG可以減少精子產(chǎn)生過氧化氫，其添加量為10μg/mL時(shí)可以明顯增加受精率，但添加量為25μg/mL時(shí)顯著降低受精率。Higdon等[33]認(rèn)為EGCG在體外能有效地減少活性氧簇，但在體內(nèi)可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子或者酶的活性來間接地發(fā)揮抗氧化劑的作用。Hi rokazu Kusakabe等[34]研究了添加EGCG對(duì)精子的影響，結(jié)果表明其對(duì)于活動(dòng)的精子，ICSI(卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù))后在第1次卵裂時(shí)，染色體結(jié)構(gòu)畸形并未增加；對(duì)于不活動(dòng)的精子，添加10μmoL的EGCG處理的卵發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)畸形。Val loraniC等[35]研究了添加EGCG對(duì)精子儲(chǔ)藏的影響，結(jié)果表明其對(duì)精子儲(chǔ)藏時(shí)染色和排序變化起到抑制作用。

卵母細(xì)胞受精的關(guān)鍵是卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)。動(dòng)物卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)時(shí)，會(huì)接觸比體內(nèi)更多的氧，產(chǎn)生的氧自由基對(duì)卵母細(xì)胞的成熟起到抑制作用，可能是因?yàn)樘砑覧GCG以后降低了卵母細(xì)胞中谷光甘肽氧化速度[36]，減緩了細(xì)胞內(nèi)部的氧化過程，后期對(duì)受精的影響也可能是因?yàn)樵诼涯讣?xì)胞前期成熟培養(yǎng)中添加的EGCG延緩了卵母細(xì)胞內(nèi)部的氧化過程[37]，從而使其能夠相比其他細(xì)胞有更長(zhǎng)的生存時(shí)間。因此添加適宜EGCG對(duì)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞在體外發(fā)育時(shí)起到抗氧化保護(hù)作用，有效地促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟以及卵母細(xì)胞受精和胚胎的發(fā)育，受精率顯著增加，并對(duì)精子的儲(chǔ)藏、發(fā)生、染色和排序變化起到抑制作用。

3 發(fā)展前景

EGCG為天然無(wú)毒性抗氧化劑，除具有很強(qiáng)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景外，根據(jù)其自身的特征，將來還應(yīng)用于體外生殖細(xì)胞的培養(yǎng)、后期胚胎發(fā)育。特別是近年來，由于空氣污染、職業(yè)接觸、生活習(xí)慣等環(huán)境變化，影響精液質(zhì)量[38]，降低了男性精液質(zhì)量和生育能力。有學(xué)者研究證實(shí)，每日適當(dāng)飲茶即可以補(bǔ)充一定量的EGCG。一杯200mL的普通綠茶中大約含有140mg的EGCG、65mg的EGC、28mg的ECG和17mg的EC[39]。我們可以推測(cè)在日常飲食中攝入適當(dāng)EGCG，可以降低精子畸形率，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的保護(hù)具有一定的積極意義。因此，隨著研究的更加深入，EGCG在體外生殖細(xì)胞的培養(yǎng)、后期胚胎發(fā)育以及對(duì)精子的影響等方面將應(yīng)用更加廣泛，具有良好的研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景。

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