王 娜,張小軍,劉永杰,陸承平

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇南京,210095)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hyd rophila),作為氣單胞菌的模式種,隸屬于氣單胞菌科(Aermonadaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas),為嗜溫、有動力的氣單胞菌群[1]。該菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人類糞便中,對水產動物、畜禽和人類均有致病性,可導致魚類的爆發(fā)性敗血癥,已給我國漁業(yè)生產帶來相當大的經濟損失。人類感染該菌可引起胃腸炎、腹膜炎、敗血癥等[1,2],是一種典型的人—獸—魚共患病病原,其致病作用已成為當今公共衛(wèi)生關注的問題。

現普遍認為嗜水氣單胞菌的致病性與其產生的毒力因子密切相關。已知的致病因子主要有外毒素(氣溶素、溶血素和細胞毒性腸毒素等)、胞外蛋白酶(絲氨酸蛋白酶、核酶和淀粉酶等)、結構蛋白(轉鐵蛋白、S層蛋白、外膜蛋白和菌毛等)和信號相關蛋白(如分泌系統(tǒng)蛋白等)。細菌分泌系統(tǒng)的發(fā)現是近年來細菌致病機制研究的重要進展。致病菌為了在宿主體內生存、繁殖和擴散,必須分泌一些蛋白性質的毒力因子;而一些非致病菌為了適應其生活環(huán)境,也向外分泌一些蛋白質。革蘭陰性菌有許多分泌蛋白和外露蛋白,雖然細菌分泌的這些蛋白功能各異,但系統(tǒng)發(fā)育和遺傳進化分析表明,細菌是通過相對較少的幾種分泌機制將這些蛋白分泌出去的。到目前為止,共發(fā)現 6種類型的分泌系統(tǒng),它們以各自特有的方式參與細菌的致病過程。其中的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(typeⅢ secretion system,TTSS)與動植物革蘭陰性病原菌的毒力因子分泌有關,因此備受關注。

1 嗜水氣單胞菌 TTSS的發(fā)現

Ⅲ型分泌系統(tǒng)是一個由多種蛋白分子的復合體所構成的跨膜蛋白輸出裝置,存在于動植物許多革蘭陰性病原菌中。在病原菌與宿主細胞接觸后,這一系統(tǒng)得以啟動,具有接觸介導的特征。啟動后細菌分泌與毒力有關的多種蛋白質,與相應的伴侶蛋白結合,從細菌的胞漿直接進入宿主細胞胞漿,發(fā)揮毒性作用[3]。已確定具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)的細菌有沙門菌(Salmonella)、志賀菌(Shigella)、耶爾森菌(Yersinia)、大腸桿菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等。

Yu等[4]首次報道了嗜水氣單胞菌 AH-1株中存在 TTSS,利用基因步移法克隆了全長的 TTSS序列,其中包括 5個啟動子,25個開放閱讀框表達 25種TTSS組分蛋白。AH-1株的TTSS定位在基因組中,而此前報道同屬的殺鮭氣單胞菌TTSS位于質粒上。插入失活其中兩個組分基因 aopB和aopD,結果發(fā)現細菌毒力顯著降低,說明TTSS與嗜水氣單胞菌致病性密切相關。隨后運用 1對保守引物檢測 TTSS在嗜水氣單胞菌不同分離株中的分布,結果 33株待檢菌株中均能擴出條帶,測序發(fā)現這 33條序列同源性很高,說明 TTSS廣泛存在于嗜水氣單胞菌菌株中。同時,在嗜水氣單胞菌PPD 134/91中發(fā)現TTSS基因島,并證實 TTSS為嗜水氣單胞菌致病機制中主要毒力因子之一[5]。

Vilches等[6]發(fā)現,TTSS廣泛分布于氣單胞菌屬不同種如嗜水氣單胞菌、維隆氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌臨床和環(huán)境分離株中,并且發(fā)現TTSS基因ascV缺失株較野生株的毒性和毒力均減弱。Sha等[7]根據耶爾森菌 TTSS組分基因yscV設計探針,在嗜水氣單胞菌人源腹瀉分離株 SSU基因組文庫中找出 26 855 bp全長的 TTSS,包含 35個基因編碼區(qū),比AH-1株多 10個基因。構建aopB基因缺失株以及細胞毒性腸毒素 act基因缺失株發(fā)現細胞毒性減弱,這兩個基因的雙缺失株則是無毒力的。這再次證明TTSS跟細菌毒力有關。AH-1與SSU的 TTSS序列比較發(fā)現,兩株菌的 TTSS同源性并不高。例如,TTSS跨膜定位裝置 aopB,aopD的基因同源性分別只有 50%,53%。雖然 SSU株與 AH-3株 TTSS都含有 35個基因,但每個基因核苷酸水平的同源性從 28%到89%不等,氨基酸水平的同源性在 38%到97%之間。序列變異導致的蛋白構象變化可能會影響TTSS向宿主注射效應蛋白。這也解釋了雖然包括無毒株在內的許多嗜水氣單胞菌都含有TTSS,但它們的結構并不完全一樣,這也許決定了它們毒力方面的差異。目前為止,已有AH-1,AH-3,SSU等3株細菌公布了 TTSS全長序列,并且檢測發(fā)現許多株嗜水氣單胞菌均含有 TTSS,但全基因組測序嗜水氣單胞菌ATCC 7966并沒有發(fā)現任何 TTSS同源序列[8]。有幾點推測:同屬的殺鮭氣單胞菌 TTSS位于質粒上,ATCC 7966的TTSS可能整合于被丟失的質粒中;ATCC 7966全基因組序列中發(fā)現與霍亂弧菌毒力分泌相關的Ⅵ型分泌系統(tǒng)同源的序列,TTSS的功能可能由新發(fā)現的Ⅵ型分泌系統(tǒng)代替;TTSS的功能由鞭毛分泌裝置代替,這在耶爾森菌中已有報道[8]。

2 TTSS效應蛋白

Ⅲ型分泌系統(tǒng)受到接觸誘導后,分泌與毒力有關的多種蛋白質注入宿主細胞內,這些蛋白稱為效應蛋白。效應蛋白借助于Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌器形成的通道,在分子伴侶的幫助下,直接從細胞質分泌到細胞外[3]。分泌過程受調節(jié)蛋白的調節(jié)。若細菌接觸上皮細胞,可將一些分泌蛋白注入宿主細胞中[3]。這些分泌的效應蛋白抑制宿主的抗細菌免疫應答機制,或者改變宿主的細胞結構以利于細菌復制并誘導發(fā)病。

人們所知的對動物致病的效應蛋白約 20余種[9～11]。其中 6種由耶爾森菌屬分泌,包括:YopE,YopH,YopM,YopJ/P,YopO/YopA,YopT;沙門菌屬 SPI-1編碼裝置分泌有 8種:AvrA,SipA,SipC,SopB,SopD,SopE,SotP,SspH 1;SPI-2系統(tǒng)分泌的有 4種:ExoS,ExoT,ExoV,ExoY;志賀菌屬分泌有 2種:IpaA,IpaC。

目前為止,嗜水氣單胞菌同屬的殺鮭氣單胞菌發(fā)現了 4個效應蛋白(AexT,AopP,AopH,AopO);嗜水氣單胞菌發(fā)現了 2個效應蛋白(AexT,AexU)。Vilches等[12]發(fā)現嗜水氣單胞菌AH-3中 ADP-核糖基化毒素(AexT)通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)遷移。缺失aexT或 TTSS基因都不能在上清中檢測到AexT存在,aexT缺失株毒力輕微下降,TTSS基因缺失株毒力顯著下降。AexT是在嗜水氣單胞菌中發(fā)現的第一個效應蛋白,也是迄今為止在嗜溫氣單胞菌中發(fā)現的最小的效應蛋白,它的發(fā)現證明了 TTSS作為功能結構在毒力因子分泌過程中發(fā)揮作用。另一個AexT類似的效應蛋白AexU發(fā)現于嗜水氣單胞菌 SSU株中[13],它也具有 ADP-糖化轉移酶的活性,與銅綠假單胞菌雙功能毒素 ExoT/S同源,殺鮭氣單胞菌中的AexT蛋白也有相同的功能。TTSS系統(tǒng)內膜復合物ascV基因缺失后AexU轉運受阻,表明AexU的分泌也是TTSS依賴型的。銅綠假單胞菌的雙功能毒素ExoT/S的功能已經了解,它的N端殘基催化 rho依賴的肌動蛋白解聚,導致細胞形態(tài)改變和可逆的細胞毒性,它的C端為ADP-核糖化轉移酶活性亞基,具有很強的細胞毒性,導致真核細胞不可逆的損傷。AexU蛋白N端殘基(231aa)與殺鮭氣單胞菌AexT蛋白N端殘基有 67%的同源性,C端殘基在NCBI數據庫中沒有發(fā)現同源蛋白,但全長的蛋白仍然具有ADP-核糖化轉移酶的活性。體外表達 AexU的全長蛋白、N端亞基、C端亞基,它們都表現出 ADP-核糖化轉移酶活性,但前 2種蛋白活性明顯高于后者。Hela細胞表達這 3種蛋白后發(fā)現肌動蛋白重組、細胞變圓、染色質濃縮,這表明 AexU在嗜水氣單胞菌感染的致病性中發(fā)揮重要作用[13,14]。Sierra[15]證實,嗜水氣單胞菌SSU株 AexU作為 ADP-核糖化轉移酶和 GTP酶活化蛋白,參與宿主細胞的凋亡和肌動蛋白的分解,AexU可以阻止c-Jun,JNK和IkB的磷酸化并抑制 HeLa細胞 IL-6和 IL-8的分泌,從而抑制 NF-kB和阻斷 Rho GTP酶的活性。aexU基因的缺失使其失去 ADP-核糖化轉移酶和GTP酶活化蛋白活性,從小鼠的死亡率和并發(fā)的促炎癥反應情況來看,AexU具有ADP-核糖化轉移酶和GTP酶活化蛋白調控其他未知活性作用。

另外,Yu等[16]研究嗜水氣單胞菌AH-1胞外蛋白發(fā)現,新的蛋白包括類似 ExoT蛋白顯示經嗜水氣單胞菌TTSS途徑分泌,同時發(fā)現嗜水氣單胞菌側生鞭毛和TTSS的相互作用。

3 嗜水氣單胞菌 TTSS對其毒力的致病性調控

眾所周知,TTSS在病原與宿主的相互作用中發(fā)揮了重要作用。Fadl等[17,18]通過構建嗜水氣單胞菌SSU株 act/aopB缺失株,通過感染小鼠,利用基因芯片等技術證實宿主感染過程轉錄水平的變化。Vilches[19]通過分析 AH-3 TTSS調節(jié)元件aopN-aopD和效應蛋白AexT啟動子,構建axsA和aopN突變株,證實其作為TTSS主要轉錄調節(jié)基因的功能。同時,TTSS的表達與其他不同毒力因子(如脂多糖、PhoPQ雙組分系統(tǒng)、ahyIR密度感應系統(tǒng)等)之間存在復雜的相互作用。這是關于嗜水氣單胞菌 TTSS調控網絡的首次報道。Carvalho-Castro等[20]利用PCR技術檢測嗜水氣單胞菌分離株中 TTSS相關基因ascV和aopB。結果表明,ascV+/aopB+在死亡率高的發(fā)病魚體內分布率高,從而揭示TTSS的存在很可能增加嗜水氣單胞菌的毒力,并可用于嗜水氣單胞菌分離株的毒力分型。

4 其它分泌系統(tǒng)

除了Ⅲ型分泌系統(tǒng),革蘭氏陰性菌尚有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型、Ⅴ型和 6型分泌系統(tǒng)。Ⅰ型可將細菌分泌物蛋白質直接從胞漿送達細胞表面,Ⅱ型則是細菌將蛋白質分泌到周質間隙,經切割加工,然后通過微孔蛋白穿越外膜分泌到胞外。Ⅳ型是一種自主運輸系統(tǒng),其分泌的蛋白質需切割加工,而后形成一個孔道使自身穿過外膜 。

嗜水氣單胞菌中已有報道的功能分泌系統(tǒng),除了Ⅲ型之外只有Ⅱ型和Ⅵ型分泌系統(tǒng)。Ⅱ型分泌系統(tǒng)由exeC-N和exeAB編碼,ExeA和ExeB貫穿內膜形成復合物。ExeA包含ATP接合位點,其 N端具有ATP酶活性,ExeA-ExeB復合物為Ⅱ型分泌系統(tǒng)組裝提供能量并且使ExeD分泌素多聚化。嗜水氣單胞菌中,Ⅱ型分泌系統(tǒng)在氣溶素(Aer)、細胞毒性腸毒素(Act)、蛋白酶、淀粉酶分泌過程中發(fā)揮作用[21～23]。嗜水氣單胞菌 ATCC 7966全基因組測序發(fā)現 6型分泌系統(tǒng)(type 6 secretion system T6SS),該系統(tǒng)只在霍亂弧菌中有過報道[8]。Suarez等[24]從嗜水氣單胞菌人源腹瀉分離株 SSU中克隆出 6型分泌系統(tǒng)全長基因,研究發(fā)現 2個毒力分泌基因(virulence-associated secretion vas)vasH和 vasK對 T6SS基因表達非常重要,其中VasH是一種σ54依賴的轉錄調控子、vasK編碼未知功能蛋白。vasH基因缺失阻止?jié)撛诘霓D移物溶血素協(xié)同調控蛋白(hemolysin coregulated protein Hcp)基因表達。vasK缺失能阻止Hcp分泌但不能阻止其向宿主細胞遷移。不管是動物試驗還是細胞試驗,均觀察到這兩種缺失株毒力下降。嗜水氣單胞菌SSU野生株小鼠攻毒后能檢測到 Hcp抗體,Hcp能和小鼠巨噬細胞接合,HeLa細胞表達 Hcp后引發(fā)細胞凋亡。隨后發(fā)現,T6SS效應蛋白VgrG1,作為肌動蛋白 ADP-核糖轉移酶活性能夠通過半胱天冬酶 9的活性使細胞凋亡[25]。這些都足以說明 T6SS在嗜水氣單胞菌感染致病性中扮演重要角色。

另外,ATCC 7966全基因組測序還發(fā)現了Ⅰ型分泌系統(tǒng),它可能跟介導黏附的毒力因子跨膜轉運有關[8]。

5 結 語

嗜水氣單胞菌廣泛存在,流行甚廣,給漁業(yè)生產帶來相當大的經濟損失。尤其由嗜水氣單胞菌引起的食物中毒、介水傳染病、感染性腹瀉、繼發(fā)感染、敗血癥等頻繁發(fā)生,其致病作用已成為當今公共衛(wèi)生關注的問題,有必要從分子、細胞、乃至與真核生物相互作用的水平認識其致病機制。研究嗜水氣單胞菌的分泌系統(tǒng)可深入揭示嗜水氣單胞菌的分子機制。隨著對各型分泌系統(tǒng)研究的深入,對嗜水氣單胞菌的進化機制、致病性以及生物體的防御體系有了更深入的了解,并由此提供了許多有趣的問題和新的研究方向。尤其對于毒力因子分泌的研究將對解析致病蛋白的分泌調控途徑,尋找阻斷細菌致病蛋白分泌的作用靶標有重要意義。研究嗜水氣單胞菌分泌系統(tǒng)效應蛋白的作用機制對于研發(fā)保護效果好、安全有效的疫苗具有一定的指導意義,同時也為嗜水氣單胞菌病的預防和治療提供新思路和新策略。

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(責任編輯:朱寶昌)