陳玉華

(黃石理工學院醫(yī)學院,湖北黃石 435003)

0 引言

癲癇是一種普遍的以慢性神經(jīng)障礙為主要特征的反復發(fā)作的疾病。實驗證實癲癇發(fā)作能殺死神經(jīng)元,主要是通過谷氨酸和它的同類物的神經(jīng)毒作用而導致細胞死亡[1]。除此之外,發(fā)作也激活凋亡途徑。凋亡信號通路是胞內(nèi)細胞器功能干擾后啟動的(內(nèi)源性途徑)或通過激活細胞表面死亡受體(外源性途徑)啟動的,由Bcl-2和caspase基因家族結(jié)合起來的信號級聯(lián)通路。在本文中,提供了從實驗發(fā)作動物模型和難治的顳葉癲癇病人臨床資料獲得的這些通路的證據(jù)。發(fā)作引起線粒體功能障礙并激活的內(nèi)源性途徑組分包括凋亡前Bal-2家族蛋白和caspases,這個過程也許由鈣離子部分誘導。外源性途徑,即死亡受體途徑,也是快速地參與到實驗發(fā)作和病人大腦中,是不依賴鈣離子的途徑。研究表明一氧化氮(nitric oxide,NO)可誘導癲癇發(fā)作后細胞凋亡的發(fā)生[2],然而 NO誘導癲癇發(fā)作后細胞凋亡機制仍不清楚。核因子-κβ(nuclear factorκβ,NF-κβ)作為一種重要的信號傳導因子,可通過其 p65/p 50異源二聚體的活化形式進入細胞核與 DNA上相應靶基因位點結(jié)合對細胞內(nèi)外界刺激作出快速反應。本文就癲癇發(fā)作誘導神經(jīng)元死亡的機制進行綜述,為癲癇發(fā)作的大腦保護和輔助治療提供理論依據(jù)。

1 癲癇持續(xù)狀態(tài)誘導未成熟大腦神經(jīng)元死亡

大量研究表明,實驗中的SE(status epilepsy,SE)誘導正在發(fā)育的大腦神經(jīng)元死亡[3]。在2周齡的SE模型小鼠中,海馬 CA 1椎體細胞層神經(jīng)元有廣泛損傷,而在齒狀回的內(nèi)部顆粒細胞層有適度的神經(jīng)元損傷。光鏡和電鏡結(jié)果表明這 2種細胞群以不同的模式死亡[4]。通過蘇木精和伊紅(HE)染色,癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)后24～72 h,CA 1損傷的神經(jīng)元以嗜酸性的胞質(zhì)溶膠和濃縮的細胞核為主要特征,這些特點是壞死的特征。而在相同動物的齒狀回,在SE后 7～72 h,嗜酸性的細胞出現(xiàn)胞核片斷化。通過電鏡的半定量分析表明 SE后6～72 h在 CA 1壞死是普遍的死亡形式[4]。在SE后 6 h顯示出早期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹,在24 h顯示出肉眼可見的細胞質(zhì)和細胞器腫脹、質(zhì)膜的喪失和斑塊狀核等明顯的壞死形態(tài)。而齒狀回損傷的神經(jīng)元表現(xiàn)出凋亡的形態(tài),如出現(xiàn)大而圓的染色質(zhì)凝塊、核膜的喪失以及質(zhì)膜的維持。

Fujikawa等研究發(fā)現(xiàn),發(fā)作誘導的神經(jīng)元死亡在很大程度上來自谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)門控的過度Na+和 Ca2+進入神經(jīng)細胞和細胞腫脹破裂、自由基產(chǎn)生,產(chǎn)生的自由基損傷 DNA和激活蛋白酶,導致細胞和細胞器質(zhì)膜的蛋白水解,最后細胞壞死[1]。谷氨酸鹽受體拮抗物保護神經(jīng)元免受發(fā)作損傷,但是由于其神經(jīng)毒的副作用,不能實現(xiàn)其治療價值,特別是對未成熟個體,這些藥物會影響其大腦的正常功能。因此,為增強藥物作用的特異性有必要尋找對發(fā)作誘導神經(jīng)元死亡可供選擇的靶標。

2 發(fā)作后的細胞死亡機制

2.1 發(fā)作激活內(nèi)源性途徑

推測內(nèi)源性凋亡途徑可能是由發(fā)作激活,因為體外實驗揭示暴露在高濃度鈣離子下的大腦神經(jīng)元線粒體釋放細胞色素 C。使用引起短期持續(xù)的局灶癲癇小鼠模型證實癲癇發(fā)作后 2 h內(nèi)損傷的海馬神經(jīng)元釋放細胞色素C,且與Apaf-1,及與之同量激活的caspases 9和caspases 3的出現(xiàn)以及隨后的DNA片段化相關(guān)。此后許多實驗室也相繼報道了發(fā)作后有caspase的激活[5]。

當單獨提高細胞內(nèi)的鈣離子也許足以激活內(nèi)源性途徑。上游前凋亡BH3結(jié)構(gòu)域(Bcl -2同源結(jié)構(gòu)域3),只有成員BAD(Bcl-2相關(guān)死亡蛋白),Bid和Bim(Bcl-2相互作用細胞死亡調(diào)節(jié)子)能通過鈣離子依賴的機制被激活,并且發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)都可以通過發(fā)作激活[6]。

研究證實內(nèi)源性凋亡途徑可以依賴藥物介入明顯激活,但是其特異性是有限的。有靶向作用的caspases或前凋亡Bcl-2蛋白雖然不是完全地但可以減少發(fā)作誘導的神經(jīng)元死亡。在小鼠中提供了更多的選擇途徑用以解決這些問題,并且新近研究的小鼠模型證實,敲除某種前凋亡或抗凋亡 Bcl-2家族基因會明顯減輕發(fā)作后的海馬損傷[7]。

另外,以難治的顳葉癲癇病人手術(shù)獲得的顳葉為研究材料,實驗發(fā)現(xiàn)顳葉癲癇病人的顳葉新皮質(zhì)表達高水平的Bcl-2,Bcl-X和激活的caspase 3。最新關(guān)于顳葉癲癇海馬的研究證實caspase 3激活并且證明前凋亡Bim基因的調(diào)節(jié)改變[6]。在海馬神經(jīng)元細胞核內(nèi)有caspase激活的DNase(但沒有AIF參與)的積累暗示caspases的下游底物也參與這個過程[8]。然而,仍不清楚病人大腦中到底哪條途徑到達細胞死亡的終點,因為在這個樣本中顯示出末端 DNA片段化的細胞很少,表明同時進行著抗凋亡過程[6]。

2.2 發(fā)作激活外源性途徑

外源性途徑即死亡受體激活,如腫瘤壞死因子受體(tumour necrosis factor receptor 1,TNFR1)與TNF-α、Fas與FasL的結(jié)合等是外源性凋亡調(diào)控途徑的起始環(huán)節(jié)。這些激活的死亡受體通過其細胞內(nèi)的死亡區(qū)域(death domain,DD)來分別募集Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associated death domain,FADD)或TRADD(TNFR-associated death domain)。FADD通過其N末端死亡效應區(qū)(death effector domain,DED)的寡聚化并激活caspase-8酶原,形成細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導復合物(death-inducing signalling complex,DISC),并負責向下轉(zhuǎn)導凋亡調(diào)控信號。TRADD一方面通過與FADD結(jié)合而誘導caspase-8酶原活化;另一方面則通過募集TRAF1、2(TNFR-associated factor1、2)及RIP(receptor interacting protein)等因子,通過一系列的信號轉(zhuǎn)導,最終可以抑制caspase-8的表達。caspase-8的抑制則表現(xiàn)出對神經(jīng)細胞的保護作用[9],同時減少一些下游事件的發(fā)生,如線粒體途徑caspase-9的裂解和細胞色素 C的釋放。研究也證實在癲癇發(fā)作早期TNFR 1和Fas表達上調(diào)及其配基TNF-α和FasL均為釋放增加,并且發(fā)現(xiàn)在發(fā)作損傷的鼠海馬中出現(xiàn) DISC,該復合物包含細胞內(nèi)分子效應器,如FADD和caspase-8[10]。在顳葉癲癇(temporal lobe eplipesy, TLE)病人的海馬中也檢測到相似的結(jié)果[11]。這些結(jié)果有力地證實了外源性凋亡調(diào)控途徑參與了 SE后神經(jīng)細胞的損傷過程。

2.3 SE在海馬CA 1區(qū)和齒狀回不同的激活通路

關(guān)于SE誘導CA 1神經(jīng)元壞死的機制近期已經(jīng)取得了進展[4,12]。通常,壞死被認為是一種被動的死亡形式,并不需要caspases蛋白水解酶的級聯(lián)激活。然而,研究表明通過啟動caspase-8依賴的caspase-3激活,促成SE誘導的神經(jīng)元壞死。在SE后7 h,CA 1椎體細胞出現(xiàn)細胞器腫脹,這是壞死的早期階段[4]。緊接著SE后24～72 h活化的caspase-3 (caspase-3a)免疫反應性增加。光鏡和電鏡研究證實大多數(shù)caspase-3a陽性的CA 1神經(jīng)元表現(xiàn)出形態(tài)學上的壞死,而且caspase-3a染色僅出現(xiàn)在細胞核。通過染色質(zhì)染料 Hoechst 33342雙標記,在CA 1大多數(shù)caspase-3a陽性的神經(jīng)元有固縮核(在 24 h有98.2%),是壞死的特征。在未固定的冷凍切片上的caspase激活檢測證實在CA 1損傷神經(jīng)元的固縮核有caspase-3的激活。通過電鏡,大多數(shù)caspase-3a免疫活性的CA1神經(jīng)元有壞死的形態(tài)學特征,如細胞質(zhì)和線粒體的腫脹以及核固縮[8]。但是,在 SE后 72 h,只有少數(shù)細胞檢測到顯著增加的活化的caspase-9免疫活性,表明內(nèi)源性途徑不能促使 SE誘導的 CA 1神經(jīng)元壞死,外源性途徑也許促使海馬CA1神經(jīng)元壞死。

而在齒狀回神經(jīng)元中,SE后 7 h和24 h,接近80%的凋亡神經(jīng)元表達caspase-3a。在SE后 7 h和 24 h,接近 70%的凋亡細胞有caspase-9免疫反應性。在SE后的齒狀回caspase-8的免疫反應性沒有顯著增加。光鏡結(jié)果也顯示,caspase-3a和caspase-9陽性的細胞出現(xiàn)大而圓的染色質(zhì)團塊或染色質(zhì)邊緣化等細胞凋亡的形態(tài)特征,以上結(jié)果表明在SE誘導的齒狀回神經(jīng)元凋亡過程中內(nèi)源性途徑起重要的作用[8]。

3 細胞成熟的水平可能決定了神經(jīng)元損傷的模式和機制

研究表明有相同海馬回路的出生后大腦神經(jīng)元細胞中,相同的發(fā)作通過不同的機制誘導神經(jīng)元死亡,原因還不確定。細胞成熟的程度也許是一個因素[13]。如在高度分化的海馬CA 1椎體神經(jīng)元,caspase-8上調(diào)優(yōu)先于caspase-3激活和壞死,而caspase-9沒有上調(diào),這是 SE誘導成熟大腦神經(jīng)元死亡的主要形式。在齒狀回凋亡的神經(jīng)元中觀察到caspase-9和caspase-3的激活,但caspase-8沒有激活。在非成熟腦的 SE模型中,嗜酸性的caspase-3a免疫活性的神經(jīng)元定位在內(nèi)部顆粒層,這是齒狀回發(fā)育到成熟的最后的一層。同時也發(fā)現(xiàn)所有caspase-3a免疫活性的神經(jīng)元是有雙倍皮質(zhì)激素免疫活性的,這是非成熟神經(jīng)元的特征,并且不表達鈣結(jié)合蛋白 -D28k,這是成熟齒狀回顆粒細胞的一個標記[9]。有趣的是,當大腦受損傷后,發(fā)育中的大腦比成熟大腦對于正在發(fā)生的凋亡更敏感。這個現(xiàn)象和參與凋亡的年齡依賴的細胞死亡因子(如 caspases)的下調(diào)是相關(guān)聯(lián)的[14-15]。從研究結(jié)果可以假設在決定發(fā)作對神經(jīng)元的易損性時,個別神經(jīng)元的成熟水平也許和整個有機體的成熟水平一樣重要。

4 癲癇發(fā)作過程中細胞凋亡與一氧化氮合酶、核因子 -β的關(guān)系

越來越多的實驗表明細胞凋亡在癲癇所致的腦損傷過程中發(fā)揮重要的作用。NO作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì),在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮復雜而重要的作用[16]。一氧化氮合酶(NOS)可以催化底物L-精氨酸生成NO。而NF-κβ是一類與轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)的蛋白質(zhì)家族。其中起主要作用的是 p65/p50異源二聚體,在胞質(zhì)中p65/p50因與抑制蛋白Iκβ(inhibitory protein kappaβ)結(jié)合而失活。當細胞受到內(nèi)外刺激時Iκβ被上游激酶所降解,NF-κβ被激活并轉(zhuǎn)入核內(nèi),與特定的 DNA序列結(jié)合發(fā)揮對靶基因調(diào)節(jié)而起到相應作用。有研究顯示NO可以通過激活一些相關(guān)的蛋白如NF-κβ等而誘導凋亡[17]。

采用戊四氮(PTZ)致癇大鼠模型的實驗研究表明,癲癇發(fā)作后細胞凋亡與NO和NF -κβ密切相關(guān)?？赡艿臋C制是:PTZ作為一種興奮性氨基酸激活N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR),使細胞內(nèi)鈣增加,進一步激活了依賴鈣-鈣調(diào)蛋白的組成型 NOS,使分泌達第1個高峰;而NO可抑制NMDAR,下調(diào)鈣內(nèi)流,使二者出現(xiàn)下降趨勢,可能參與了癲癇的發(fā)生和早期腦保護;但隨著驚厥時間的延長, NOS再次升高,與細胞凋亡和NF-κβ有明顯的時間相關(guān)性,提示后期產(chǎn)生的 NOS可能是不依賴鈣的誘導型一氧化氮合酶(iNOS),從而產(chǎn)生了過多的NO,而是通過誘導NF-κβ的產(chǎn)生而造成了神經(jīng)元凋亡。研究者同時檢測了癲癇發(fā)作過程中細胞凋亡、NOS和NF-κβp65的表達,提示 NO早期輕度表達可能與癲癇發(fā)生和早期腦保護有關(guān),而后期的過度表達可能通過誘導NF-κβp65表達導致細胞凋亡的發(fā)生。

5 展望

總之,癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的死亡形式與損傷的強度和線粒體的功能狀態(tài)有關(guān),線粒體構(gòu)成了神經(jīng)元存亡的控制中心。細胞色素 C的釋放和caspase的激活是神經(jīng)元損傷的最后共同通路。發(fā)作損傷后凋亡信號途徑促成神經(jīng)元喪失,在 TLE病人中也參與顳葉結(jié)構(gòu)的改變。采用鼠模型對感興趣的靶基因的長期研究應該更進一步闡明癲癇發(fā)生和這些信號途徑之間的關(guān)聯(lián)性。最后,在癲癇發(fā)生過程中,凋亡信號途徑中某個基因的新功能意味著表達水平和活性的改變,也許影響發(fā)作敏感性和神經(jīng)元重建。

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