汪少蕓， 趙 珺， 吳金鴻， 陳 琳

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350002;2.上海交通大學生物與食品學院，上海 290002)

抗凍蛋白的研究進展及其在食品工業(yè)中的應用

汪少蕓1， 趙 珺1， 吳金鴻2， 陳 琳1

(1.福州大學生物科學與工程學院，福建福州 350002;2.上海交通大學生物與食品學院，上海 290002)

抗凍蛋白是一類具有熱滯效應、冰晶形態(tài)效應和重結(jié)晶抑制效應的蛋白質(zhì)，因其特殊的結(jié)構和功能，抗凍蛋白引起了研究人員的極大興趣.探討了近年來抗凍蛋白的研究進展，介紹了目前已知的抗凍蛋白的來源、特性、測定方法、基因結(jié)構及在食品工業(yè)中的應用.抗凍蛋白對冷凍食品有顯著的品質(zhì)改良功能，是未來冷凍食品工業(yè)中極具潛力的抗凍添加劑.

抗凍蛋白;熱滯活性;冰晶抑制;食品添加劑

低溫凍害對大多數(shù)生物體是致死性的，它導致細胞內(nèi)環(huán)境脫水、結(jié)晶，造成細胞物理性的損害或死亡［1］.極地海洋和加拿大東部沿海水域的冬季水溫大約在－1.8℃左右，這一溫度遠遠低于一般海洋魚類血液的冰點(－0.7～－0.9℃)，但是仍有許多魚類在這一低溫環(huán)境下繼續(xù)生存，盡管魚體直接與冰接觸，卻不發(fā)生凍結(jié)現(xiàn)象［2－3］.生物體能夠采取一些策略適應高山、極地等寒冷的環(huán)境，包括合成一種血清蛋白阻止其血液結(jié)冰，這種血清蛋白就是抗凍蛋白(antifreeze proteins，AFPs).抗凍蛋白是一類抑制冰晶生長的蛋白質(zhì)，它能以非依數(shù)性形式降低水溶液的冰點而對其熔點影響甚微，于是導致水溶液的熔點(melting point，MP)和冰點(freezing point，F(xiàn)P)之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性(thermal hysteresis activity，THA)，因而抗凍蛋白亦稱為熱滯蛋白或溫度遲滯蛋白(Thermal Hysteresis Proteins，THPs)［4］.抗凍蛋白是保護機體在結(jié)冰或亞結(jié)冰條件下(接近并高于結(jié)冰溫度)免受傷害的蛋白質(zhì)家族中的一種，它可以非依數(shù)性地降低機體胞外基質(zhì)和體液的冰點同時使熔點不變，這個過程被稱作熱滯后［4－5］.

抗凍蛋白最早在極地魚類中發(fā)現(xiàn)，到目前，科學家已經(jīng)在魚類、昆蟲、植物、細菌和真菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種抗凍蛋白［6］.盡管這些不同來源的抗凍蛋白無論結(jié)構或活性都存在很大的差異，但是其抗凍機理是一致的，即都是通過與冰晶結(jié)合，或者通過影響冰晶的形狀及大小來發(fā)揮作用.基于抗凍蛋白影響冰晶結(jié)構的這一特性，對抗凍蛋白的最新定義是“Ice Structuring Protein”，即制約冰晶結(jié)構的蛋白質(zhì)［7］.抗凍蛋白以其獨特的功能和潛在的商業(yè)價值引起了眾多學者的關注，抗凍蛋白在低溫冷鏈的眾多食品加工和運輸過程也發(fā)揮著重要的作用.

1 抗凍蛋白的來源

至今，在魚、昆蟲、植物和細菌等生物體中發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白，按照來源的不同，抗凍蛋白被分類為魚類抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白、植物抗凍蛋白和細菌抗凍蛋白.

1.1 魚類抗凍蛋白

1.1.1 抗凍糖蛋白(AFGPs)

AFGPs主要存在于生活在兩極的某些魚類中，如齒魚類(Dissostichus)、貝氏肩鲞(Trematomus bernacchii)及北半球高緯度海域中的魚如大西洋鱈(Gadus morhua)、北鱈(Boreogadus Saida)的血液中［8］.AFGPs主要由 3 肽糖單位［-Ala-Ala-Thr(雙糖基)-］以不同重復度串聯(lián)而成.AFGPs的分子量一般為2.5～33.7 ku，糖基是抗凍活性形成的主要基團，且活性與分子量有關，分子量大者，一般活性也高［9］.推測它形成一種與多聚脯氨酸Ⅱ相似的左手螺旋結(jié)構，其雙糖疏水基團面向碳骨架，親水基團面向溶液［10］.

1.1.2 Ⅰ型抗凍蛋白(AFPⅠ)

AFPⅠ在美洲黃蓋鰈魚(Pseudopleuronectus americanus)、床杜父魚(Myaxocephalus scorpius)等中存在［11］.AFPⅠ的一級結(jié)構是由11個氨基酸殘基組成的多肽單元［-Thr-(Ala)2-Asx-(Ala)7-］重復串聯(lián)而成.Ala含量約為65%，分子量為3.3～4.5 ku.Asn/Asp的比例和Thr是確定其抗凍功能的主要影響因子.通過X-射線研究其晶體結(jié)構，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構全為α-螺旋，且為雙親螺旋結(jié)構，這樣其親水氨基酸具有較大的擺動能力，可以粘附到不同的冰晶表面，抑制冰晶生長［12］.

1.1.3 Ⅱ型抗凍蛋白(AFPⅡ)

AFPⅡ在幾種魚類如海渡鴉、胡爪魚和鯡魚等的血清中存在.顯著特點是Cys含量比較高(約為8%)，并且半數(shù)Cys都能形成二硫鍵，用巰基乙醇或二硫蘇糖醇處理都會導致熱滯活性喪失，因此這些二硫鍵對保持分子結(jié)構穩(wěn)定性及抗凍活性有重要作用.AFPⅡ的分子量為11～24 ku，是魚類 AFP中分子量最大的一類.它也是唯一在蛋白質(zhì)序列庫中查出與其他蛋白質(zhì)具有同源性的AFPs［13］.根據(jù)AFPⅡ和C型凝集素碳水化合物識別區(qū)域同源的特點，進行類比分析，認為AFPⅡ有2個α-螺旋，2個β-折疊和大量無規(guī)則結(jié)構［14］.

1.1.4 Ⅲ型抗凍蛋白(AFPⅢ)

AFPⅢ主要存在于幾種Zoarcoid科的魚中，如大頭鰻鱺和狼魚.從南極大頭鰻鱺(Austrolycicthys branchycephalus)的血清中分離出兩種AFPⅢ.而從另一種南極大頭鰻鱺(Lycodichthys dearborni or Rhigophila dearborni)的血漿中發(fā)現(xiàn)了8種AFPⅢ，它們是同一類球蛋白，在這種AFPs中Ala和Cys的含量都不高，分子量為6.5～14 ku.對一種含66個殘基的AFPⅢ用NMR和X-射線衍射技術分析表明:其二級結(jié)構主要由9個β-折疊組成，其中8個β-折疊組成三明治夾心結(jié)構，另一個β-折疊則游離在其外，這種三明治結(jié)構的“夾心”是2個反向平行的3個串聯(lián)β-折疊，外邊則是2個反向平行的β-折疊［13］.

1.1.5 Ⅳ型抗凍蛋白(AFPⅣ)

Ⅳ型抗凍蛋白含有108個氨基酸，分子量約為12.3 ku，并且含有高達17%的Glu，N-末端連接有一個焦谷氨?；鶊F.該抗凍蛋白的序列與膜載脂蛋白非常相似，通過圓二色譜分析表明該蛋白和載脂酰蛋白也具有類似結(jié)構:有較高的α-螺旋結(jié)構，其中4個α-螺旋反向平行排列折疊成一個螺旋束.疏水基團向內(nèi)，親水基團向外，親水基的表面可與冰晶結(jié)合，魚可以把它作為一種屏障來阻止冰晶從皮膚表面滲入.該蛋白很有可能是由膜載脂蛋白進化而來［14］.

1.2 昆蟲抗凍蛋白

一些越冬的昆蟲體內(nèi)存在超活性的AFP，維持其體液的過冷(Supercooling)狀態(tài).目前昆蟲中抗凍蛋白的分離純化主要在4種昆蟲中開展，分別為黃粉蟲(Tenebrio molitor)、美洲脊胸長椿(Oncopeltus fasciatus)、樅色卷蛾(Choristoneura fumiferana)和Dendroides canadensis.

昆蟲抗凍蛋白的分子量一般為8～9 ku，無糖基，與魚類AFPⅠ型相似，含有較多的親水性氨基酸(例如 Thr，Ser，Asx，Glx ，Lys，Arg)，有 40% ～59%的氨基酸殘基能形成氫鍵［14］.有些昆蟲AFPs類似于魚類 AFPⅡ，含有一定數(shù)量的半胱氨酸［15］.一般來講，昆蟲抗凍蛋白抑制冰晶生長的活性更高于魚類或植物抗凍蛋白［16］.它的最大活性可能達到魚類抗凍蛋白最大活性的3～4倍，而且在毫摩爾濃度其活性會比魚類抗凍蛋白的活性高出10～100倍［17］，分子結(jié)構也大不一樣，這可能與冬季陸地的溫度更低有關［13］.

1.3 植物抗凍蛋白

植物生長發(fā)育過程中，溫度作為一個重要的環(huán)境因子對其生長、生殖和分布起著關鍵的作用.低溫不僅在很大程度上限制植物的種植范圍，同時還會造成減產(chǎn)和品質(zhì)下降，嚴重時甚至絕收［18］.

植物抗凍蛋白同時具有抗凍、抗病雙重功能.植物抗凍蛋白提高植物抗凍性的主要途徑不是阻止冰晶的形成，而是調(diào)控胞外冰晶的增長及抑制冰的重結(jié)晶，避免冰晶增大而產(chǎn)生致死性的機械損傷［19］.植源性AFP主要分布于南北回歸線以外高緯度地區(qū)以及高山高寒區(qū)，常見的有高山雪蓮［20］、胡蘿卜［21－22］、黑麥草［23］、沙冬青［24］等，它們共同的特點是都經(jīng)受了冷誘導，因此可以推測產(chǎn)生AFP是植物本身應對外界寒冷變化的一種策略［25］.苦甜茄屬(Solanum dulcamara)AFP，分子量為12.4 ku，含有兩個分別由56和57個氨基酸殘基組成的鋅指結(jié)構域，兩個鋅指結(jié)構域之間為酸性結(jié)構域，第1個鋅指結(jié)構域上游為富含Glu的區(qū)域，C-端有10個保守的13個氨基酸的重復［26］.長青黑麥(Lolium perenne)AFP，分子量為 40.0 ku，其N-端20個氨基酸殘基為 SDDLSFIFNKFVPCQTDILF，為糖蛋白，該序列與植物凝集素有較高同源性［27］.

1.4 細菌抗凍蛋白

在加拿大北極地區(qū)的植物根際中發(fā)現(xiàn)一種根瘤菌(Pseudomonas putida GR12－2)，能耐受 －20℃和－50℃的冰凍溫度而存活下來，在5℃生長溫度下，會合成和分泌一種具有抗凍活性的蛋白質(zhì).這種蛋白質(zhì)分子量為164 ku的糖脂蛋白，實驗證實了這種菌抗凍的機制之一是 AFP的聚集［28－29］.

來源于南極洲的細菌中有6種可以產(chǎn)生抗凍蛋白，其中熱滯活性最高的一種AFP是由82號菌株(Moraxella sp.)產(chǎn)生的一類脂蛋白(AFLP)，N-端氨基酸順序與該菌的外膜蛋白有很高的相似性，這是首次報道的第一類抗凍脂蛋白［30］.

2 抗凍蛋白的性質(zhì)

抗凍蛋白幾種特殊的性質(zhì)，使之具有不同于其他蛋白的“抗凍”活性，即保護低溫作用.

2.1 熱滯活性

抗凍蛋白具有熱滯活性，抗凍蛋白能以非依數(shù)形式降低水溶液的冰點但不影響其熔點，冰點和熔點的差值稱為熱滯活性，差值越大抗凍活性越大［29］.抗凍蛋白抗凍作用的大小與本身的性質(zhì)有關而與數(shù)量無關，AFPs的這種特性稱為抗凍作用的非依數(shù)性(noncolligative).AFPs降低魚血清、昆蟲、植物體液或水溶液冰點的效率比一般溶質(zhì)要高，按重量濃度算比NaCl的效率高2倍;按摩爾濃度算，比 NaCl的效率高200～500倍，這說明 AFPs降低體液冰點的機制與鹽類(如 NaCl)不同，一般溶液(如NaCl，蔗糖溶液等)的冰點是固、液兩相蒸汽壓平衡時的溫度，因而冰點等于熔點［9］.而 AFPs在其溶液中只影響結(jié)冰過程，幾乎不影響熔化過程，所以使冰點低于熔點［8］.影響熱滯活性的因素主要有AFP濃度、肽鏈長度和一些小分子量溶質(zhì).AFP濃度越大，熱滯活性越大;高分子量糖肽比低分子量糖肽熱滯活性更強;一些小分子量溶質(zhì)如檸檬酸鹽、甘油和山梨醇能顯著阻止冰核的形成，提高昆蟲的熱滯活性［31］.

2.2 改變冰的生長習性

抗凍蛋白具有冰晶形態(tài)效應，改變冰的生長習性，而且這種作用在不同方向上有強弱之分，由此引起冰晶形態(tài)的改變.冰通常以平行于晶格基面(a軸)的方式生長，在垂直基面(c軸)很少生長，因此冰晶格呈扁圓狀.低濃度AFP優(yōu)先抑制冰沿a軸生長，因此冰晶格的六邊柱表面變得明顯.而在高濃度AFP下，冰晶格主要沿c軸生長，形成六邊雙棱錐及針形晶體［9，32］.

2.3 重結(jié)晶抑制效應

抗凍蛋白還具有重結(jié)晶抑制效應，在低于溶點幾度的溫度下，冰有重結(jié)晶的趨勢，即大的冰晶可以取代小的冰晶，而抗凍蛋白可能通過控制發(fā)生冰凍的組織中冰晶的大小和形狀減緩或阻止這一過程［28］，以形成體積小而比較均勻的晶體.在范德華力、疏水相互作用和氫鍵作用下［33］，抗凍蛋白吸附到液體中的冰核表面，抑制冰核生長并降低冰點［34－35］，保護有機體免受結(jié)冰引起的傷害［36］.在耐凍植物內(nèi)和耐冰昆蟲(僅限于細胞外結(jié)冰)體內(nèi)，重結(jié)晶抑制作用可能比熱滯效應更為重要.AFPs主要通過重結(jié)晶抑制作用來避免冰晶體對細胞組織的傷害，因為重結(jié)晶化的抑制作用比冰晶生長的抑制作用更容易達到，只需少量 AFPs(20 μg/mL)就有較高的重結(jié)晶化抑制活性［37］.

2.4 降低過冷卻點

抗凍蛋白能夠調(diào)節(jié)動植物原生質(zhì)體的過冷狀態(tài)，使過冷點降低.過冷卻點低于昆蟲體液的臨界溫度是昆蟲致死的主要原因，而抗凍蛋白可以抑制促進冰晶生長的冰核蛋白的活性，調(diào)節(jié)原生質(zhì)溶液的過冷狀態(tài)，降低過冷卻點，使昆蟲具有抗寒能力［8］.越冬植物AFP可能也具有此功能，但目前還缺乏足夠的證據(jù)［29］.

2.5 保護細胞膜

魚中發(fā)現(xiàn)的 AFPs可以和細胞膜結(jié)合，增加膜的穩(wěn)定性從而起到抗凍作用，在昆蟲中也發(fā)現(xiàn)部分AFPs位于細胞膜上，在低溫甚至零度以下可增強細胞的活性［29，38］.AFPs還可以抑制玻璃化損傷，這也許通過阻斷Ca2+和K+離子通道達到對細胞膜的保護作用［8］.

3 抗凍活性的測定

不同于其他蛋白質(zhì)的活性測定，抗凍蛋白的活性測定基本都要涉及“低溫”過程，所以其操作穩(wěn)定性和操作成本就成為設計、建立活性測試方法的挑戰(zhàn).至今，根據(jù)抗凍蛋白的上述性質(zhì)，已經(jīng)建立起來的抗凍活性測定方法包括熱滯活性的測定和低溫保護活性的測定.

3.1 熱滯活性的測定

3.1.1 傳統(tǒng)測定法

早期的測定方法是把抗凍蛋白樣品溶液加入毛細玻璃管中，密封，通過降低溫度或其他方法，使樣品結(jié)冰，然后使溫度回升，部分融化結(jié)冰，保留一個晶核［39］.把裝有樣品的毛細管放入盛有預冷的溫度稍微低于樣品冰點的95%乙醇的浴鍋中，緩慢降溫或升溫，通過放大鏡觀察冰核增大或縮小，冰核緩慢生長或融化的溫度分別為冰點和熔點，二者之差即為熱滯活性［40］.這種方法不需要儀器，但操作復雜，且誤差較大，后來被進一步改進［41］:把樣品溶液盛在玻璃皿中，放入有恒溫器調(diào)溫，溫度稍微低于樣品冰點的95%乙醇的浴鍋中，取出玻璃皿，迅速加入氟利昂，誘導形成冰核，然后重新放入浴鍋中.用200 W白熾燈做光源，光線通過準直儀和極性過濾器進入浴鍋，樣品皿的圖像通過4倍光學放大鏡投射在白色屏幕上.在黑色的各向同性的液相背景下，可以看到冰晶的生長和縮小［40］.通過精確的熱變電阻器來監(jiān)測溫度，如果浴鍋溫度稍微低于樣品冰點，晶體緩慢生長，20 min增加0.5 mm.生長速度略高于此的溫度即視為冰點，晶體縮小速度略高于此的溫度即視為熔點［39］.

3.1.2 納升滲透壓計法

納升滲透壓計(nanoliter osmometer)是一種冰點滲透壓計，測量溶液冰點下降的精密儀器.它既能夠緩慢升溫和降溫，又能夠快速升溫和降溫.在納升滲透壓計系統(tǒng)中，可以借助顯微鏡來觀察冰晶的增大或縮小.抗凍蛋白加在鈉鹽緩沖液中［39］.樣品板放在滲透壓計系統(tǒng)電熱控溫的顯微鏡臺上.該鏡臺利用珀爾帖效應(peltier effect)能夠在0～－9℃(誤差為0.01℃)范圍內(nèi)調(diào)節(jié)溫度，而且可以通過快速冷凍方式達到－40℃的低溫.運用很細的毛細管向樣品槽中心加入一滴(大約10 μL)樣品.通過快速降溫到－40℃，樣品快速冷凍.然后溫度升高，部分熔化樣品，直至留下一個50～63 μm的冰晶.小心升溫或降溫，誘導冰晶緩慢生長或緩慢縮小的溫度分別看作冰點和熔點，二者之差即是樣品的熱滯活性［40］.

3.1.3 差示掃描量熱法

差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC法)是一種熱分析法，測量輸入到試樣和參比物的熱量與溫度的關系，主要通過測定體系結(jié)晶過程中吸熱和放熱的變化，檢測體系發(fā)生的物理變化.可以通過測定升溫及降溫過程中熱焓的變化來判斷冰點與熔點，確定真實的結(jié)晶起始溫度，進而獲得準確客觀的熱滯活性測定結(jié)果，而且DSC法可以精確測定體系的冰晶含量，缺點在于檢測花費的時間較長，需要高精度的設備［42］.

張超等［43］用差示掃描量熱法測定了重組胡蘿卜抗凍蛋白的熱滯活性，將等體積的樣品與參比溶液密封于鋁制坩堝中放置在樣品池中央，通過升溫降溫過程記錄樣品的結(jié)晶溫度、保留溫度等參數(shù)，最后根據(jù)公式計算得出該重組胡蘿卜抗凍蛋白的熱滯活性為(0.095 7±0.003 68)℃，并對其穩(wěn)定性、專一性和精密度進行了評價.

3.1.4 量熱儀法

量熱儀法是利用一種液氮氣化掃描量熱儀(liquid nitrogen resistance thermometer，LNRT)，通過樣品與液氮熱交換的過程測定，進行樣品量熱.張黨權［44］等采用高精度的量熱儀(Model 5614 Platinum LNRT)來檢測重組表達的胡蘿卜抗凍蛋白的熱滯活性.該儀器的精確度為0.01℃，采用液氮進行程序降溫，通過計算機采集并分析數(shù)據(jù).此方法操作簡單方便，重復性較好.

3.2 低溫保護活性的測定

3.2.1 細菌低溫保護

抗凍保護實驗是通過低溫處理細菌培養(yǎng)液之后，平板培養(yǎng)一段時間然后計數(shù)菌落數(shù)來統(tǒng)計細菌的存活率，存活率越高，抗凍蛋白的低溫保護活性越高.或者采用分光光度計測定經(jīng)低溫處理后的細菌培養(yǎng)液的OD600值作為指標，OD600值越高，表明細菌個數(shù)越多，抗凍蛋白的低溫保護活性越高［45］.

3.2.2 細胞低溫保護

細胞低溫保護實驗與細菌低溫保護實驗過程相似，但其將細胞放置在低溫條件不同時間后還要將細胞再回到37℃復溫，測量細胞的LDH釋放量、ATP含量及WST－8等指標.其中，LDH是一種細胞質(zhì)酶，存在于所有組織中，在大多數(shù)哺乳動物中常常都會表達，在許多病理情況下引起血漿水平升高.當細胞膜受外界影響而變性，細胞內(nèi)LDH則開始泄漏，細胞外LDH活性隨著細胞膜的破壞而增加，由此反映出被損傷細胞的比率;ATP含量，即細胞能量水平，測定細胞內(nèi)ATP含量能夠進一步表征低溫保存對細胞的損傷;保存細胞的生存能力可以通過WST－8還原法來評價，它可以反映出胞內(nèi)酶通過依賴NADH脫氫酶系統(tǒng)而將WST－8還原的能力［46］.LDH越低，胞內(nèi)ATP含量越高，胞內(nèi)WST－8減少量越大，則抗凍蛋白的低溫保護性越高.

3.2.3 冰淇淋低溫保護

將抗凍蛋白樣品與不含穩(wěn)定劑、抗凍劑的冰淇淋基體(ice cream basic mix)混合，取一定量滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，將載玻片放入熱量平臺，然后迅速冷卻，保持一段時間后用顯微鏡記錄下該狀態(tài)下的冰晶形態(tài).接著再以一定的速度將樣品緩慢升溫并做冷熱循環(huán)(cold-heat-stage-cycle)后用顯微鏡記錄冰晶形態(tài)［47］.這樣，通過軟件分析冰晶顆粒的大小與均勻程度就可以推斷出樣品的抗凍活性，冰晶顆粒越小、越均勻，則說明抗凍蛋白的抗凍活性越高.

4 抗凍蛋白基因

研究發(fā)現(xiàn)，AFP是被多基因家族編碼的，4類AF的基因均被克隆，它們都是串聯(lián)重復的多基因家族［48］.抗凍糖蛋白AFGP基因序列中結(jié)構基因是46個正向串聯(lián)的同源性片段，44個是編碼AFGP8，2個是編碼AFGP7的，每個片段編碼一個AFGP和三肽內(nèi)含子.冬鰈基因組中約含40個AFP基因拷貝，其中2/3是正向串聯(lián)重復排列，每個AFP重復序列中含有一個AFP基因，幾個AFP基因的轉(zhuǎn)錄方向均相同，其余1/3也是相連，但被不規(guī)則的間隔區(qū)分開.大多數(shù)能夠產(chǎn)生抗凍蛋白的生物體內(nèi)并不只有單一的分子結(jié)構，而是有一組異源分子同時具有抗凍活性.

魚類具有10個以上可確定的分子結(jié)構具有抗凍活性.有些抗凍蛋白在生物體內(nèi)有多個拷貝存在，最多可以達到100個以上.北半球魚類AFP也是多基因家族編碼，經(jīng)研究證明冬鰈單位體基因中約含AFP基因的40個拷貝，其中2/3是正向串聯(lián)重復排列，每個AFP重復序列中含有一個AFP基因，幾個AFP基因的轉(zhuǎn)錄方向均相同，其余1/3也是相連但被不規(guī)則的間隔區(qū)分開.冬季比目魚皮膚和肝中的抗凍蛋白基因都是多拷貝的(30～40個)，其皮膚型抗凍蛋白不含有分泌信號肽及其前體，說明這類抗凍蛋白是在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的.肝型抗凍蛋白基因主要在肝中，少量在腸道中表達;而皮膚型抗凍蛋白基因在肝以及皮膚、鰭、鱗、鰓等外部組織中都能表達，表明其在保護外部組織免受凍害中發(fā)揮著重要的作用［48］.從12月份的甲蟲(Dendroides canadensis)幼蟲的cDNA文庫中，分離到了10個可能的抗凍蛋白基因，說明這種抗凍蛋白也是由多基因簇編碼的［49］.海渡鳥基因組中AFPⅡ有12～15個拷貝，其序列測定表明，2～2kbDNA序列為6個AFP外顯子，其兩側(cè)25kb范圍未能檢測到第二個該基因拷貝，大概該基因拷貝是較大重復的單一部分.北冰洋綿鳚基因組AFPⅢ的0～7kb長基因約有150個拷貝，其中大多數(shù)拷貝是相連的，但不像冬鰈那樣正向串聯(lián)重復，而是由10～12個不規(guī)則間隔的基因聚集成簇［49］.樅色卷蛾(Choristoneura fumiferana)AFPs基因Afp-Lul和 Afp-Iul的克隆.該AFPs基因有著相似的結(jié)構:外顯子串聯(lián)在一起，其間由3～316kb的內(nèi)含子隔開［50］.

抗凍蛋白在生物體內(nèi)的表達受溫度和季節(jié)變化的影響而改變，從夏季到冬季抗凍蛋白及其mRNA的量可以成倍地增加，最高可以達到1 000倍.冬季比目魚肝型抗凍蛋白mRNA的量可以達到夏季量的幾百倍，而腎和鰭中抗凍蛋白mRNA的量只有5～10倍的變化［48］.樅色卷蛾幼蟲抗凍蛋白轉(zhuǎn)錄比較特殊，主要受發(fā)育時期的調(diào)控，而不是受季節(jié)性低溫調(diào)控［51］.該特性為生物在冰凍環(huán)境中獲得盡可能多抗凍蛋白的保護提供了遺傳學基礎.

5 抗凍蛋白在食品工業(yè)中的應用

冷凍食品業(yè)在食品工業(yè)中所占的份額越來越大，低溫冷鏈中眾多食品發(fā)生結(jié)晶和重結(jié)晶現(xiàn)象對細胞組織結(jié)構發(fā)生破壞作用，造成細胞內(nèi)汁液流失.水的結(jié)晶導致溶液的局部濃縮現(xiàn)象又促使細胞內(nèi)組分的性質(zhì)發(fā)生改變，發(fā)生蛋白質(zhì)變性、淀粉回生等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象最終使產(chǎn)品品質(zhì)受到嚴重破壞［52］.作為一類新型的食品添加劑，抗凍蛋白可以有效減少冷凍貯藏的食品中冰晶的形成和重結(jié)晶，而提高低溫冷鏈系列食品的質(zhì)量.

5.1 在冷凍乳制品中的應用

評價冰淇淋質(zhì)量高低的一個重要的指標是其中的冰晶體越細小越好.如果在冷藏、運輸、銷售任何一個冷鏈環(huán)節(jié)出現(xiàn)較高的溫度就會發(fā)生重結(jié)晶現(xiàn)象，生成較大的晶體，從而影響冰淇淋的口感.添加抗凍蛋白可以有效防止冷凍貯藏的食品中冰晶的形成.美國的DNAP公司將 AFP添加于冰淇淋和牛奶中，消除了冰渣，改善了質(zhì)量和口味［31］.Wang［53］等將冰淇淋經(jīng)過cold-heat-stage處理后用顯微鏡觀察冰晶生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加有抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶細小且均勻，而未加抗凍蛋白的冰淇淋樣品冰晶大且不均勻.

5.2 在冷卻/冷凍肉中的應用

肉制品的冷凍、冷藏中，加入AFPs可以有效地減少滲水和抑制冰晶的形成，保持原來的組織結(jié)構，減少營養(yǎng)流失［29］.據(jù)報道，將AFPG于屠宰前注入羔羊體內(nèi)，宰后肉體經(jīng)真空包裝，在－20℃凍藏2～16周，然后解凍，觀察肉的冷凍質(zhì)量.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在屠宰前1 h或24 h注射AFPG，均可有效降低冰晶體的體積和液滴的數(shù)量.AFPG終注射濃度達到0.01 mg/kg時，特別是在宰前24 h注射時，可以獲得最小的冰晶體［7］.

抗凍蛋白已能進行人工合成，因其具有潛在的商業(yè)價值，美國已通過遺傳路線開發(fā)出了這種產(chǎn)品［54］.在食品中的應用還包括保護柑桔果實免受冷凍損傷，保護烘焙品(特別是面包烘焙用酵母，需經(jīng)歷冷凍－解凍循環(huán)和貯存)及啤酒酵母等，它們在冷凍食品領域的應用被認為幾乎是無限的.

5.3 在果蔬保鮮中的應用

速凍果蔬在凍藏解凍過程中常出現(xiàn)的主要問題是汁液流失、軟爛、失去原有的形態(tài).造成汁液流失的原因與食品的原料處理、凍結(jié)方式、包裝、凍藏條件以及解凍方式有關，而最關鍵的因素則是凍藏過程中的溫度波動導致重結(jié)晶［8］.運用基因工程的方法，將異源高活性抗凍蛋白基因轉(zhuǎn)移到果蔬上并使之表達，得到的轉(zhuǎn)基因果蔬能夠有效改善這種狀況.

5.4 在冷凍面團技術中的應用

冷凍面團技術是一種烘焙食品加工新技術，一方面由中心工廠進行面團攪拌、切塊、成型、冷凍，另一方面由烘焙房、超市、快餐店在需要時進行解凍、醒發(fā)和烤制［55］.然而，冷凍面團經(jīng)過長時間凍藏，面團的品質(zhì)會下降，如醒發(fā)時間延長，面包比容減小等［56］.Zhang［57］等研究了抗凍蛋白對冷凍面團質(zhì)地特性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加抗凍蛋白的實驗組冷凍面團的硬度比對照組更加柔軟和穩(wěn)定，這主要是因為較低的結(jié)冰水含量.

食品在低溫貯藏、運輸?shù)冗^程中，抗凍蛋白有效抑制其冰晶的形成和重結(jié)晶化而使食品保持質(zhì)地的柔軟性，并能減少滴液以防止營養(yǎng)成分的損失.目前，由于抗凍蛋白的售價很高，僅適宜于研究和專門的應用，因此，如何不斷地降低抗凍蛋白的成本，是實現(xiàn)其在食品工業(yè)中廣泛應用的關鍵.

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(責任編輯:葉紅波)

Research Progress in Antifreeze Proteins and Application in Food Industry

WANG Shao-yun1， ZHAO Jun1， WU Jin-hong2， CHEN Lin1
(1.College of Biological science and Engineering，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350002，China;2.College of Biology and Food Science，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 290002，China)

Antifreeze proteins(AFPs)are the thermal hysteresis proteins that have the ability to modify the growth and inhibit the recrystallization of the ice.Antifreeze proteins aroused great interests of many researchers due to its special structure and functions.In this article，the recent advance in antifreeze protein was reviewed，and the types，properties，measurements，gene structures of antifreeze protein，and its applications in food industry were introduced.The application trials indicated that antifreeze protein could significantly improve the qualities of frozen foods，which suggested the potential food additives of antifreeze protein in future frozen food industry.

antifreeze proteins;thermal hysteresis activity;crystallization inhibition;food additives

TS202.3;TQ936.2

A

1671-1513(2011)04-0050-08

2011－03－28

國家自然科學基金資助項目(31071498);國家自然科學基金資助項目(31000814).

汪少蕓，女，教授，博士，主要從事食品生物化學方面的研究.