張秀軍,高潤(rùn)平,張瑞娟,朱 杰

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝病內(nèi)科,吉林長(zhǎng)春 130021）

肝纖維化是以各種慢性致病因素作用于肝臟大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM）在肝內(nèi)合成和沉積為特征。在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中,肝臟慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC）激活,轉(zhuǎn)化為具有表達(dá)а-平滑肌動(dòng)蛋白(а-SMA）、增殖活性的肌成纖維樣細(xì)胞,激活的HSC是肝臟ECM產(chǎn)生的主要細(xì)胞[1]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）是一種具有分泌特性的細(xì)胞基質(zhì)蛋白,其與TGF-β1共同誘導(dǎo)肝纖維化的發(fā)生。CTGF是TGF-β1誘導(dǎo)大鼠HSC、胰星狀細(xì)胞、成骨細(xì)胞合成I型膠原的下游介導(dǎo)者[2-4]。近來Gressner等[5]報(bào)道慢性丙型肝炎和酒精型肝炎患者血清CTGF的升高可直接反應(yīng)其肝纖維化的進(jìn)展情況。本研究通過檢測(cè)慢性乙型肝病患者血清CTGF的水平,探討血清CTGF水平與肝組織CTGF表達(dá)及肝纖維化程度的相關(guān)性,以評(píng)價(jià)血清CTGF水平在慢性乙型肝病(CLD-B）患者肝纖維化診斷中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2008年10月至2009年6月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院肝膽胰內(nèi)科門診和住院CLD-B患者(血清HBsAg均為陽性）共155例,其中CHB 89例,男56例,女33例,平均年齡43.5±24.6歲;活動(dòng)性肝硬化35例,男23例,女12例,平均年齡42.7±19.3歲;靜止性肝硬化31例,男21例,女10例,平均年齡45.2±20.8歲。肝硬化患者按Child-Puph分級(jí),肝儲(chǔ)備功能A級(jí)46例,B級(jí)20例。對(duì)照組30例為健康者,從我院體檢中心募集,其中男18例,女12例,平均年齡33.3±13.6歲。

1.2 樣品采集與處理空腹采集所有患者及健康對(duì)照者靜脈血4 mL,留取血清凍存于-80℃冰箱備用。對(duì)其中31例肝臟活體穿刺標(biāo)本經(jīng)常規(guī)甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色及Van Gieson氏膠原染色,進(jìn)行肝組織炎癥分級(jí)和纖維化分期。

1.2.1 血清CTGF檢測(cè) ELISA法檢測(cè)人血清CTGF,試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL。操作流程按說明書進(jìn)行,使用Bio-Rad 550酶標(biāo)儀(USA）在波長(zhǎng)450 nm測(cè)得OD值,根據(jù)樣品OD值及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品的濃度。

1.2.2 肝組織CTGF mRNA檢測(cè) 采用多項(xiàng)寡核苷酸探針和高敏感標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)人肝組織CTGF mRNA,試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。操作步驟參見試劑盒說明書。采用AEC顯色,胞漿出現(xiàn)紅色顆粒為陽性細(xì)胞,蘇木素復(fù)染,水性封膠封片。采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)Image-Pro Plus 6.0,對(duì)每張切片隨機(jī)取10個(gè)400×視野,掃描CTGF mRNA陽性細(xì)胞,計(jì)算其平均積分光密度值(integrated optical density,IOD）。

1.2.3 免疫組化染色檢測(cè)肝組織α-SMA UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,鼠抗人α-SMA單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。肝組織α-SMA檢測(cè)按試劑盒說明書進(jìn)行。DAB顯色,蘇木素復(fù)染。陰性對(duì)照用PBS緩沖液代替一抗。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,血清CTGF水平用±s表示,兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn);Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 CTGF mRNA在肝組織的表達(dá)

CHB肝小葉內(nèi)竇周間隙可見α-SMA表達(dá)陽性的激活HSC(圖1A）,激活的HSC是表達(dá)CTGF mRNA的主要細(xì)胞(圖1B）。CTGF mRNA陽性的細(xì)胞在LC纖維化條帶內(nèi)部及周邊被檢出(圖1C）,與膠原纖維分布一致(圖1D）。

2.2 血清CTGF的測(cè)定結(jié)果

慢性乙型肝炎、活動(dòng)性肝硬化患者血清CTGF水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.01）,靜止性肝硬化患者血清CTGF水平亦高于正常對(duì)照組(P＜0.05）?；顒?dòng)性肝硬化和慢性乙型肝炎患者血清CTGF水平之間比較差異無顯著性(表1）。

圖1 CHB組織病理學(xué)

表1 CLD-B患者及健康對(duì)照者血清CTGF測(cè)定結(jié)果(±s）

表1 CLD-B患者及健康對(duì)照者血清CTGF測(cè)定結(jié)果(±s）

注:與對(duì)照組比較,*P＜0.01,△P＜0.05

組別 n CTGF(μ g/L）對(duì)照組 30 2.21±0.42慢性乙型肝炎 89 9.15±3.35*活動(dòng)性肝硬化 35 9.73±3.60*靜止性肝硬化 31 5.42±2.56△

2.3 CTGF與肝纖維化分期及炎癥分級(jí)的關(guān)系

CLD-B患者肝纖維化程度越重肝組織CTGF mRNA表達(dá)越強(qiáng),血清CTGF水平越高,Spearman相關(guān)分析顯示CLD-B患者血清CTGF水平與肝組織CTGF mRNA表達(dá)及纖維化的程度呈正相關(guān)關(guān)系(r=724,r=0.549,均為P＜0.05）。(表2）

CLD-B患者血清CTGF水平與肝組織炎癥程度無相關(guān)性(P＜0.05）。

表2 CLD患者血清和肝組織CTGF水平與肝纖維化分期的關(guān)系(±s）

表2 CLD患者血清和肝組織CTGF水平與肝纖維化分期的關(guān)系(±s）

纖維化分期 n CTGF(μ g/L） CTGF mRNA(IOD）S0 4 2.35±0.46 8.18±4.23 S1 4 4.27±1.63 19.54±9.46 S2 8 5.74±1.67 24.71±12.13 S3 7 7.26±1.83 32.36±15.35≥S4 8 8.56±1.78 38.76±18.41

3 討論

慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV）感染是肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的主要原因[6]。Martín-Vílchez S等通過體外細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)的研究證實(shí):肝細(xì)胞通過表達(dá)和分泌HBV X蛋白(HBx）刺激人HSC激活和增殖,使 CTGF和 I型膠原合成增加[7]。近來,Liu Xuan等采用HepG2.2.15培養(yǎng)上清刺激人肝星狀細(xì)胞株(LX-2）,結(jié)果顯示:HBV可短暫感染LX-2細(xì)胞,并直接刺激LX-2增殖,使I型膠原的合成明顯增加[8],這些研究為HBV致肝纖維化提供了直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。我們先前的研究表明:靶向CTGF的錘頭核酶通過阻斷內(nèi)源性CTGF的合成,有效抑制基礎(chǔ)和TGF-β1誘導(dǎo)的人HSC合成I型膠原和細(xì)胞向S期轉(zhuǎn)化[9],說明CTGF在HSC介導(dǎo)肝纖維化發(fā)生學(xué)起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)CHB患者肝組織竇周間隙激活的HSC表達(dá)CTGF mRNA,CTGF mRNA陽性的細(xì)胞可在LC纖維化條帶內(nèi)部及周邊檢出,且與膠原纖維分布具有良好的一致性,這就從組織病理學(xué)進(jìn)一步說明CTGF在HSC介導(dǎo)慢性HBV感染所致肝纖維化發(fā)生學(xué)的作用。

在過去的5-10年中,其他來源的纖維原性細(xì)胞亦在肝纖維化病灶中檢出,包括骨髓源性纖維細(xì)胞、門管區(qū)纖維原細(xì)胞及由肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成的肌成纖維樣細(xì)胞[10-12],這些細(xì)胞在不同原因所致肝纖維化發(fā)生學(xué)發(fā)揮相應(yīng)的作用,并受制于相應(yīng)疾病進(jìn)程[13]。既往普遍認(rèn)為定居于肝小葉竇周間隙的HSC在慢性乙、丙型肝炎患者肝纖維化發(fā)生學(xué)起著重用的作用,本研究發(fā)現(xiàn)CHB門管區(qū)炎癥部位有CTGF mRNA表達(dá)陽性的纖維原細(xì)胞,其有可能參與CTGF介導(dǎo)的慢性HBV感染所致肝纖維化的發(fā)生學(xué)。

CTGF是一種分泌型基質(zhì)蛋白,其與TGF-β1共同承擔(dān)肝纖維化發(fā)生的功能。本研究表明:CLD-B患者血清CTGF水平與肝纖維化程度呈正相關(guān),進(jìn)一步提示血清CTGF可作為CLD-B患者反映進(jìn)展性肝纖維化的一種血清標(biāo)志。

目前,在世界范圍內(nèi)普遍將肝活檢組織病理學(xué)作為診斷肝纖維化的“金標(biāo)準(zhǔn)”[15]。然而肝活檢存在創(chuàng)傷性,取樣誤差,加上病理觀察者的變異等缺點(diǎn),而影響肝纖維化診斷的準(zhǔn)確性。近年來通過檢測(cè)血清HA、LN、C IV,來評(píng)價(jià)在肝纖維化診斷方面的價(jià)值,但特異性和敏感性并不理想。本研究通過檢測(cè)CLD-B患者血清和肝組織CTGF水平,評(píng)價(jià)其與肝組織纖維化分期及炎癥分級(jí)的關(guān)系,結(jié)果表明:血清CTGF的升高水平與肝組織CTGF mRNA表達(dá)強(qiáng)度及肝纖維化程度呈正相關(guān)關(guān)系,而與肝組織炎癥程度無關(guān)。因此認(rèn)為,檢測(cè)血清CTGF對(duì)診斷CLD-B患者肝纖維化具有實(shí)際臨床意義。

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