李志軍,蘇智軍,林成祖,郭如意,林萬松

2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院感染病科,泉州362000;

3.福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤微生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州350001

23株HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者病毒的全基因組分析*

李志軍1,蘇智軍2,林成祖2,郭如意2,林萬松3

目的研究HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者HBV變異特點(diǎn)。方法 PCR擴(kuò)增并克隆HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者血清中HBV全基因組DNA,測序并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果 獲得23株HBV全基因組DNA,它們均屬于C或B基因型。與中國HBV B、C基因型參照序列相比,HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者來源的HBV在表面抗原、P蛋白、X蛋白的反式激活區(qū)及增強(qiáng)子II/核心啟動子區(qū)發(fā)生了一些有意義的共有變異。結(jié)論 HBV變異可能與HBeAg陽性慢性乙型肝炎的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

乙型肝炎病毒;基因變異;全基因組

2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院感染病科,泉州362000;

3.福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤微生物學(xué)福建省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州350001

據(jù)WHO估計(jì),全球大約有20億人感染了乙型肝炎病毒(HBV),約有3.5億人患有慢性感染[1]。我國是乙肝大國,HBV感染率為50.1%,乙肝表面抗原攜帶率約占總?cè)丝诘?.18%,以此計(jì)算,全國約有9300萬人攜帶 HBV,其中乙肝患者大約有3000萬[2]。研究顯示,HBV一些特定位點(diǎn)的變異可以引起慢性乙型肝炎抗病毒治療的失敗。另外,由于大多數(shù)的研究是以HBV的部分片段或特定位點(diǎn)作為研究對象,并不能反映病人體內(nèi)病毒的真實(shí)狀態(tài),具有一定的局限性。為了更好的理解HBV的生物學(xué)特征,本文采用全基因克隆的方法,了解HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者HBV變異特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 血清 標(biāo)本來自福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院11例和福州市傳染病院12例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者2006-2009年血清共23例。所有病例診斷按2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會西安會議修訂的病毒性肝炎防治方案診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 pSure-T載體購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司,DH5α菌株購自Invitrogen公司,蛋白酶 K、酵母tRNA購自Sigma公司,限制性內(nèi)切酶HindⅢ、T4 DNA ligase購自Biolab公司。Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity購自Ivitrogen公司,膠回收及質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自上海超世生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血清 HBV DNA 抽提 100 μ L血清加入300 μ L TES 液 (10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0,5 mmol/L EDTA,0.5%SDS,50μ g Protease K),混勻,65℃消化過夜,等體積苯酚/氯仿及氯仿抽提各1次,上清加入2倍體積無水乙醇、1/10體積3 mol/L醋酸鈉(pH 4.8)及20μ g酵母tRNA,DNA沉淀以70%乙醇漂洗1次并溶于50μ L滅菌雙蒸水中。

1.2.2 HBV DNA全基因擴(kuò)增 引物參照Günther等方法[3]設(shè)計(jì)并改進(jìn),正向引物序列:5′CCCAAGCT TGAGCTCT TCT TT TTCACCTC TGCCTAATCA 3′, 反 向 引 物 序 列:5′CCCAAGCT TGAGCTCT TCAAAAAGTTGC ATGGTGCTGG 3′。PCR擴(kuò)增條件:反應(yīng)體積25μ L。各成分的終濃度為:2.5 mmol/L MgSO4,0.2 mmol/L dNTP,正反向引物各20pmol,lxPCR緩沖液,5 uL抽提HBV DNA,1U高保真DNA聚合酶。擴(kuò)增采用熱啟動方式,即:反應(yīng)先經(jīng)預(yù)變性95℃3min,待溫度上升至80℃后加入T aq/pwo聚合酶,隨后進(jìn)入循環(huán)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95℃40s,61℃1min,68℃3min(第 1-20循環(huán));94℃40s,61℃1min,68℃3min(第21-35循環(huán),引物延伸時間每循環(huán)遞增5s);最后68℃延伸10min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物克隆及重組子的篩選 PCR產(chǎn)物回收后與pUC18在4℃連接16 h,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。在含氨芐青霉素及X-gal、IPTG平板上挑取白色菌落,堿裂解法抽提DNA,以HindⅢ酶切鑒定。

1.2.4 HBV DNA基因組序列測定 以ABI371型DNA自動熒光序列分析儀進(jìn)行序列測定。所用測序引物包括pUC18通用引物及HBV DNA特異性引物。

1.2.5 HBV DNA及各編碼區(qū)氨基酸分析 基因型分析:采用Vector NTI 10.0分析軟件對所分離的HBV DNA通過序列比較進(jìn)行基因型歸類,基因型分析采用的標(biāo)準(zhǔn)株為:基因型 A(X02763、X51970、AF090842),基 因 型 B (D00329、AF100309、AB033554),基因型 C(M12906、X04615、AB014381),基 因 型 D (X65259、AB048702、X85254),基因型 E(X75664、X75657、AB091256),基因型 F(AB036910、AF223965、X69789),基因型 G(AF160501、AB064310和AF223965),基因型 H(AY090454、AY090457 和AY090460)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以中國HBV B、C基因型參照序列[4]為標(biāo)準(zhǔn)序列。

2 結(jié) 果

2.1 乙型肝炎病毒全基因組DNA擴(kuò)增及克隆從23份HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者血清中擴(kuò)增出3 215 bp的HBV全基因組。將HBV全基因組DNA通過T-A克隆至pSure-T載體,以ABI 3730XL全自動熒光序列分析儀進(jìn)行序列測定。

2.2 基因型 以已知的標(biāo)準(zhǔn)A-H型HBV全基因組DNA為參照,以VectorNTI10.0軟件對所獲得的全基因組 HBV DNA進(jìn)行基因型分析,結(jié)果顯示,在所獲得的23株HBV中,B基因型為12例,C基因型為11例。

2.3 乙型肝炎病毒各編碼區(qū)氨基酸及基因調(diào)控區(qū)變異 本研究的23例(B12,C11)血清標(biāo)本中,與中國HBV B、C基因型參照序列相比,B基因型的主要變異位點(diǎn)分別位于:nt753T,nt1368A,nt1752G,nt2699G,nt2712T,nt3097C;C基因型的主要變異位點(diǎn)分別位于:nt31C,nt934C,nt1762T,nt1764A,nt2681G,nt2699G,nt3026C,nt3166C。

2.3.1 preS及S區(qū)氨基酸變異在preS1區(qū),B基因型的HBV株在60位氨基酸發(fā)生A→V突變,C基因型的HBV株在84位氨基酸發(fā)生I→L突變見表1,在preS2區(qū),雖然有核苷酸的變異,但卻沒有氨基酸突變。另外,HBV B基因型在S區(qū)第200位氨基酸發(fā)生F→Y變異。

2.3.2 P區(qū)氨基酸變異HBV B基因型在P區(qū)第136位氨基酸發(fā)生Y→H突變,此突變位于 TP區(qū)。C基因型在P區(qū)264位氨基酸發(fā)生P→H突變,此突變位于space區(qū);在314位氨基酸發(fā)生P→S突變,位于逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū);另外,在615位氨基酸發(fā)生 L→I突變,位于RH 區(qū)。

2.3.3 增強(qiáng)子II/核心啟動子區(qū)變異 增強(qiáng)子II(1685-1773nt)和核心啟動子區(qū)(1742-1849nt)重疊區(qū)域有3個位點(diǎn)的氨基酸變異。分別為B基因型1752位核苷酸出現(xiàn)G→A變異,C基因型1762位核苷酸及1764位核苷酸分別出現(xiàn)出現(xiàn)T→A及A→G變異。

2.3.4 X區(qū)變異 X蛋白的編碼區(qū)(1374-1838nt)與增強(qiáng)子II/核心啟動子區(qū)交叉重疊。增強(qiáng)子II/核心啟動子區(qū)在1752、1762、1764位核苷酸的變異導(dǎo)致X蛋白在116、130、131位氨基酸發(fā)生變異。上述130、131位氨基酸發(fā)生變異位于X蛋白的反式激活區(qū)內(nèi)(120-140aa)。

3 討 論

慢性乙型肝炎的發(fā)生過程是HBV與宿主細(xì)胞相互作用與共同演變的過程,HBV的生物學(xué)特性可顯著影響其致病過程。

慢性乙型肝炎病毒變異在不同地區(qū)存在很大差異,既有基因型間的差異,也有個別核苷酸位點(diǎn)的差異,我國流行株主要為B、C基因型。本研究獲得的23株HBV均為B或C基因型,與中國大陸慢性乙型肝炎的HBV基因型一致。HBV基因型與慢性乙型肝炎的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

preS1區(qū),B基因型60位氨基酸A→V突變位點(diǎn)、C基因型84位氨基酸I→突變位點(diǎn)為preS1抗體的結(jié)合區(qū)域(58-100aa)[5],該區(qū)域氨基酸變異可能影響病毒清除,與病毒的持續(xù)感染有關(guān)。研究結(jié)果顯示包膜蛋白變異位于已知的抗體結(jié)合區(qū)域或B/Th/Tc細(xì)胞表位內(nèi),提示HBV的免疫逃逸可能是乙型肝炎慢性化的原因之一。由于TP區(qū)與干擾素療效密切相關(guān),因此P基因TP區(qū)多個位點(diǎn)的變異對干擾素治療的影響有待進(jìn)一步研究;同樣位于RT、RH區(qū)的變異對慢性乙型肝炎的影響需要進(jìn)一步加以研究。

1762位點(diǎn)A-T和1764位點(diǎn)G-A雙突變(A1762T,G1764A)為核心啟動子最常見的變異。核心啟動子區(qū)突變也能阻止HBeAg的產(chǎn)生,而不會影響HBV的復(fù)制或核心抗原的表達(dá),只是選擇性下調(diào)前核心mRNA的轉(zhuǎn)錄,但不影響前基因組RNA[6]。且與前核心區(qū)變異不同,檢測發(fā)現(xiàn)核心啟動子變異在HBeAg陰性和HBeAg陽性患者中的比例類似[7]。本研究中,這些位點(diǎn)卻并沒有發(fā)生上述所說的變異,可能與所選病例都為 HBeAg陽性患者有關(guān)。

X蛋白可反式激活包括原癌基因在內(nèi)的多種細(xì)胞及病毒基因[8],與肝癌的發(fā)生有關(guān)。由于X蛋白編碼區(qū)與增強(qiáng)子II及核心啟動子相重疊,增強(qiáng)子II及核心啟動子的核苷酸變異可引起相應(yīng)位置X蛋白氨基酸的變異,本研究中130、131位氨基酸位于X蛋白的反式激活區(qū),這些氨基酸變異與X蛋白的激活活性有待進(jìn)一步研究。

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Structural analysis of 23 full-length hepatitis B virus genomes isolated from HBeAg positive chronic hepatitis B patients

LI Zhi-jun,SU Zhi-jun,LIN Cheng-zu,GUO Ru-yi,LIN Wan-song
(Department of Infectious Diseases,Quanzhou First Hospital Af filiated
toFujian Medical University,Quanzhou362000,China)

To study the characteristics of full-length Hepatitis B Virus(HBV)genomes isolated from HBeAg positive chronic hepatitis B(CHB)patients.Amplified the full-length HBV genomes by PCR from the serum of HBeAg positive CHB patients,sequenced and analyzed the structure of HBV genomes.Obtained twenty-three full-length HBV DNAs from the different CHB patients.Phylogenetic analysis revealed that all HBV strains could be categorized into genotype B or C.Structural analysis showed that,as compared to standard strains of Chinese HBV B、C subtypes,HBV obtained shared meaningful consensus mutations in B/T cell epitopes of surface and P protein,transactive domain of X protein and enhancer II/core promoter regions.Genotype and gene mutation of HBV may closely correlated with the carcinogenesis of HBV-related chronic hepatitis B.

Hepatitis B virus;full-length Gene mutation genomes

R373

A

1002-2694(2011)08-0728-03

*國家自然科學(xué)基金資助課題(30840069);2008年福建醫(yī)科大學(xué)科研項(xiàng)目資助課題(FZS08002)和2007年泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(2007Z15)聯(lián)合資助

蘇智軍,Emial:su2366@sina.com

1.福州市第一醫(yī)院,福州 350001;

2011-02-17;

2011-06-12