劉 茜，武 松，湯林華，周水森，黃 芳，潘嘉云，王學(xué)忠，楊曼尼，卓瑪央金

2.中國(guó)疾病控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所，世界衛(wèi)生組織瘧疾、血吸蟲病和絲蟲病合作中心，上海 200025；

3.云南省寄生蟲病研究所，普洱 665000；

4.西藏自治區(qū)林芝地區(qū)疾病預(yù)防控制中心，林芝 860100

課題組于2007與2010年在西藏瘧疾流行區(qū)墨脫縣進(jìn)行媒介調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該縣的按蚊主要包括多斑按蚊復(fù)合體和帶足按蚊，對(duì)多斑按蚊復(fù)合體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室種型鑒定發(fā)現(xiàn)包括偽威氏按蚊和威氏按蚊［1］，其中偽威氏按蚊為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)蚊種，在偽威氏按蚊中采用巢氏PCR方法檢測(cè)出間日瘧原蟲SSU r DNA基因特異序列［2］，從而從分子角度判定偽威氏按蚊為該瘧疾流行區(qū)的傳瘧媒介。云南省與西藏瘧疾流行區(qū)相鄰，偽威氏按蚊在該省分布廣泛。課題組擬采用線粒體細(xì)胞色素B基因?qū)ξ鞑?、云南和緬甸拉咱市的偽威氏按蚊進(jìn)行群體遺傳分析，以期為云南省偽威氏按蚊在瘧疾傳播作用方面提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集 所有按蚊成蚊標(biāo)本課題組采集于2007年西藏與云南及緬甸現(xiàn)場(chǎng)。采集到的按蚊經(jīng)過形態(tài)學(xué)鑒定至多斑按蚊復(fù)合體，帶回實(shí)驗(yàn)室采用分子方法進(jìn)行具體種型鑒定。5個(gè)群體共獲偽威氏按蚊共44份樣本用于mt DNA－Cytb基因群體遺傳分析，見表1。

表1 偽威氏按蚊采集地點(diǎn)與編號(hào)Tab.1 Anopheles pseudowillimori collection spot and ID

1.2 mt DNA－Cytb基因擴(kuò)增

1.2.1 基因提取 采用簡(jiǎn)易快速DNA提取法［3］，即將1～2個(gè)蚊腿置于1.5 m L離心管，加入35μL裂解液（10 mmol/L p H8.0 Tirs HCL，1 mmol/L EDTA，1%Nonidet P－40 100μg/m L蛋白酶 K），勻漿；再加入35μL消毒雙蒸水，煮沸5 min；10 000 r/min離心2 min，取上清液置－30℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 擴(kuò)增體系與條件 采用文獻(xiàn)報(bào)道的擴(kuò)增方案［4］，正 向 引 物：5′－GGA CAA ATA TCA TTT TGA GGA GCA ACA G－3′；反向引物為：5′－ATT ACT CCT CCT AGC TTA TTA GGA ATT G－3′。擴(kuò)增體系為50μL，體系包括10×PCR緩沖液5.0 μL，4.5μL MgCl2（25 mmol/L），1.0μL d NTPs（10 mmol/L），正、反向引物0.8μL（20 mmol/L），2.5 μL redTaq聚合酶（1U/μL），1.5μL DNA 模板，33.9μL dd H2O。反映條件94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，45℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃孵育8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序結(jié)果以Chromas（Version 2.13）進(jìn)行核對(duì)，必要時(shí)手工調(diào)整，序列比對(duì)采用Clustal X進(jìn)行，MEGA軟件包統(tǒng)計(jì)序列特征，包括堿基含量、轉(zhuǎn)換和顛換的數(shù)目等，并計(jì)算序列的差異性（p距離），依據(jù)差異性構(gòu)建鄰接樹（Neighbor Joining Tree，NJ）。將序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為ARLEQUIN（Version 3.0）可識(shí)別的文件后，統(tǒng)計(jì)和計(jì)算各群體的基因序列堿基分化參數(shù)，置換位點(diǎn)數(shù)目、單倍型的類型和在群體中的分布等。單倍型之間的系譜關(guān)系由TCS 1.21［5］）軟件包構(gòu)建。群體遺傳結(jié)構(gòu)由ARLEQUIN的AMOVA模塊計(jì)算，包括群體間的分化參數(shù)Fst（F－statistics）、基因流水平Nm（Nm＝1－Fst/4Fst）和群體內(nèi)和群體間的變異成分。

2 結(jié) 果

2.1 擴(kuò)增情況 受檢偽威氏按蚊DNA標(biāo)本均擴(kuò)增出mt DNA－Cytb基因目標(biāo)片段，擴(kuò)增片段約為445 bp，所有的擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中觀察，均為單一、清晰的條帶，長(zhǎng)度與預(yù)期一致。

2.2 偽威氏按蚊mt DNA－Cytb序列特征 測(cè)序獲得偽威氏按蚊Cytb基因共44條，比對(duì)序列，發(fā)現(xiàn)差異極小，經(jīng)GenBank的BLAST比對(duì)，確認(rèn)該序列片段為特異擴(kuò)增的Cytb基因。在序列比對(duì)后，取其中的420 bp部分片段進(jìn)行后續(xù)分析，結(jié)果顯示，堿基置換的位點(diǎn)為26個(gè)，其中23處轉(zhuǎn)換（50.0%），2處顛換（7.69%），1個(gè)超變位點(diǎn)（3.85%），共27個(gè)單倍型（61.36%），其中有6個(gè)單倍型在群體中共享，見表2。該片段的平均AT含量為75.6%，GC含量為24.4%。

2.3 單倍型之間的關(guān)系 將本研究得到的偽威氏按蚊Cytb基因的33個(gè)單倍型應(yīng)用TCS1.21軟件包建立95%簡(jiǎn)約家系網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），網(wǎng)絡(luò)圖中每個(gè)圈代表其中一個(gè)單倍型，空白部分是未檢測(cè)到的單倍型，在家系網(wǎng)絡(luò)圖中各單倍型呈高水平的平行演化，COI＿DX02（18）、COI＿DX01（12）和 COI＿M(jìn)N16（5）在群體中的分布豐度較高，分別占27.69%、18.46%和7.69%，COI＿DX02作為外群的最大可能值0.2125，Cytb＿cy15作為外群的最大可能性為0.1925。應(yīng)用Mega軟件包計(jì)算本研究偽威氏按蚊mt DNA－Cytb基因單倍型之間的遺傳距離，并依據(jù)遺傳距離構(gòu)建聚類關(guān)系樹（圖2），樹的拓?fù)潢P(guān)系顯示各單倍型之間的聚類關(guān)系沒有明顯的與地理分布呈相關(guān)性。

圖1 偽威氏按蚊mtDNA－Cytb基因單倍型的家系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Family constellation network map of mtDNA－Cytb haplotypes of Anopheles pseudowillimori

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu) 分步AMOVA計(jì)算結(jié)果顯示，群體內(nèi)變異絕對(duì)大于群體間變異，群體內(nèi)差異占總差異的98.30%，群體間占1.70%，見表2，所有群體的Fst值為0.016 96，見表3，Nm為4.168，大于1，提示基因流水平可以完全抵御遺傳漂變?cè)斐傻娜后w分化，群體間幾乎沒有發(fā)生遺傳分化。本研究結(jié)果顯示西藏墨脫縣與云南景洪群體間Fst值最大（0.086 50），云南勐臘與緬甸拉咱市、察隅和墨脫群體間的Fst值依次為－0.081 12、－0.003 81和－0.103 03；墨脫與緬甸拉咱市群體間的Fst值為－0.005 12，提示上述群體相互間基因流水平非常高，群體遺傳分化程度很小。

圖2 偽威氏按蚊mtDNA－Cytb基因單倍型之間的聚類關(guān)系Fig.2 Cluster relation of mtDNA－Cytb haplotypes of Anopheles pseudowillimori

表2 偽威氏按蚊群體mtDNA－Cytb序列基本數(shù)據(jù)摘要Tab.2 mtDNA－Cytb gene data of Anopheles pseudowillmori population

表3 偽威氏按蚊群體mtDNA－Cytb基因AMOVA分析Tab.3 mtDNA－Cytb AMOVA analysis of Anopheles pseudowillmori population

3 討 論

多斑按蚊（Anophelesmaculatus）由Theobald于1901年定名，模式產(chǎn)地為香港，隸屬按蚊屬，塞蚊亞屬，新塞蚊系，主要分布于東洋區(qū)（Oriental region），從印度次大陸，經(jīng)東南亞至中國(guó)臺(tái)灣。多斑按蚊過去一直被認(rèn)為是單一蚊種，后經(jīng)科學(xué)家多年研究證實(shí)，發(fā)現(xiàn)多斑按蚊是由多個(gè)形態(tài)相似的蚊種組成的復(fù)合體，多斑按蚊復(fù)合體在我國(guó)主要分布于北緯34°以南地區(qū)，是山區(qū)、半山區(qū)及河谷地區(qū)的主要蚊種。目前該復(fù)合體已經(jīng)包括9種，Harbach［6－7］最終確立多斑按蚊復(fù)合體有9成員種，即多斑按蚊（An.maculatus）、威氏按蚊（An.willmori）、偽威氏按 蚊 （An.pseudowillmori）、塞 沃 按 蚊 （An.sawadwongporni）、達(dá)羅毗按蚊（An.dravidicus）、異形按蚊（An.dispar）、諾他按蚊（An.notanandai）、格林按蚊（An.greeni）和多斑按蚊核型 K，其中前5種在我國(guó)有分布。姬淑紅［8］和陸寶麟［9］對(duì)我國(guó)5種多斑按蚊復(fù)合體的形態(tài)鑒別特征進(jìn)行系統(tǒng)闡述。多斑按蚊復(fù)合體成員種形態(tài)非常相似，其部分成員種是馬來西亞、泰國(guó)、老撾等國(guó)主要傳瘧媒介之一［10－12］。

課題組前期研究在西藏瘧疾流行區(qū)墨脫縣發(fā)現(xiàn)，偽威氏按蚊為該地的主要傳瘧媒介，云南省與西藏自治區(qū)相鄰，董學(xué)書［13］發(fā)現(xiàn)多斑按蚊復(fù)合體中的偽威氏按蚊、威氏按蚊和多斑按蚊在云南省為全省分布，占云南山區(qū)、半山區(qū)和河谷區(qū)按蚊總數(shù)的42.68%，其中偽威 氏占 22.44%，多斑 按蚊占9.35%，甚至在云南省某些地區(qū)多斑按蚊復(fù)合體占捕獲按蚊的比例高達(dá)94.6%，為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)蚊種［14］。并經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多斑按蚊與偽威氏按蚊和瘧疾發(fā)病關(guān)系密切，推測(cè)可能為傳瘧媒介；但都因未能發(fā)現(xiàn)子孢子感染的直接證據(jù)，未能確定其為傳瘧媒介。本研究從群體遺傳學(xué)的角度，探討了西藏瘧疾流行區(qū)墨脫縣、察隅縣與云南省勐臘、景洪和緬甸拉咱市偽威氏按蚊的群體遺傳分化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)各群體間基因交流頻繁，尚未發(fā)生群體間的分化。另群體內(nèi)變異（98.30%）遠(yuǎn)大于群體間變異（1.70%），提示偽威氏按蚊可能曾經(jīng)歷過近期群體擴(kuò)張事件，且目前仍處于群體擴(kuò)張階段，故mt DNA－cytb基因序列的核苷酸變異主要發(fā)生在于群體內(nèi)個(gè)體間研究，結(jié)果也暗示了云南省的偽威氏按蚊理論上也應(yīng)具備瘧疾的傳播能力，應(yīng)該加強(qiáng)云南省偽威氏按蚊傳瘧能力的研究。

［1］武松，潘嘉云，王學(xué)忠，等.西藏墨脫縣瘧疾流行區(qū)多斑按蚊復(fù)合體種型鑒定［J］.中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2008，26（4）：286－289.

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