屈振亮，崔乃強(qiáng)，趙二鵬

丙型肝炎病毒（HCV）感染是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，大量研究證實(shí)肝癌組織內(nèi)可以檢測(cè)到HCV RNA[1]。有研究發(fā)現(xiàn)肝門部膽管癌組織內(nèi)可檢測(cè)到HCV 5’末端非編碼區(qū)(5’NT)序列以及HCV C蛋白的表達(dá)[2]，但也有研究并未在肝門部膽管癌組織內(nèi)檢測(cè)到HCV標(biāo)志物[3]，為進(jìn)一步了解HCV在肝膽腫瘤組織中的存在情況，我們采用熒光定量PCR方法，檢測(cè)手術(shù)切除的新鮮肝膽腫瘤組織內(nèi)HCV RNA含量。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 收集我院2009年7月—2011年7月間手術(shù)切除的膽道腫瘤14例，其中肝門部膽管癌10例，膽囊癌2例，膽管下端癌2例；肝癌11例，其中肝細(xì)胞癌10例，肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌1例。另取病毒性肝炎組織6例，作為對(duì)照。手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本，切成1 cm×1 cm大小，液氮內(nèi)快速冷凍后，置-80℃保存。

1.2 血清抗-HCV檢測(cè) 抗-HCV診斷試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程有限公司，包被抗原含有HCV結(jié)構(gòu)區(qū)核心抗原及非結(jié)構(gòu)區(qū)抗原。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)HCV抗體。

1.3 組織RNA提取 采用SV Total RNA Isolation System（Promega）提取組織總RNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，提取的組織RNA溶解在無(wú)核酶水，經(jīng)Bio Photometer蛋白核酸測(cè)定儀（Eppdorf）定量，上樣前將樣本量稀釋至0.5 μg/μL。

1.4 HCV RNA定量檢測(cè) HCV核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）購(gòu)自上?？迫A生物工程有限公司。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液配制：PCR主反應(yīng)液:酶混合液:熒光探針=7∶5∶0.5，混勻后分裝在PCR毛細(xì)反應(yīng)管，每管12.5 μL。每個(gè)反應(yīng)管加入樣本量12.5 μL，共50 μL，逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增一步完成，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照、強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性對(duì)照、4個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)品。PCR擴(kuò)增反應(yīng)液和樣本液混合后離心15 s，置LightCycler?480擴(kuò)增儀（Roche）進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為：50℃25 min后94℃預(yù)變性2 min，93℃3 s、55℃ 15 s、72℃ 15 s共5個(gè)循環(huán)，隨后93℃ 3 s、60℃45 s共42個(gè)循環(huán)，最后40℃30 s完成擴(kuò)增反應(yīng)。熒光檢測(cè)通道選擇F1。

1.4 結(jié)果判定 陰性對(duì)照的測(cè)定結(jié)果為0，工作品測(cè)定值的線性相關(guān)系數(shù)≥0.95。測(cè)定值＜500 copies/mL判定為結(jié)果陰性，而≥500 copies/mL判定為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 膽道腫瘤患者血清抗-HCV和組織HCV RNA陽(yáng)性率 本組14例膽道腫瘤患者，無(wú)1例抗-HCV陽(yáng)性，而且檢測(cè)的組織HCV RNA亦無(wú)1例陽(yáng)性。膽道腫瘤患者的臨床資料及血清抗-HCV、組織HCV RNA檢測(cè)結(jié)果見表1。

表1 14例膽道腫瘤患者的臨床資料及HCV檢測(cè)結(jié)果

2.2 肝癌和肝硬化患者血清抗-HCV和組織HCV RNA陽(yáng)性率 本組11例肝癌和6例肝硬化患者血清中，各有1例抗-HCV陽(yáng)性，而檢測(cè)的其相應(yīng)組織內(nèi)HCV RNA陽(yáng)性，見表2。1例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者血清中乙型肝炎病毒（HBV）和HCV標(biāo)志物均陰性，但其余9例肝癌患者和5例肝硬化患者血清HBV標(biāo)志物陽(yáng)性。

3 討論

HCV是肝癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素之一，但是否也是膽管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素，觀點(diǎn)不一，爭(zhēng)議很大。雖有部分研究發(fā)現(xiàn)在肝門膽管癌組織內(nèi)可檢測(cè)到HCV RNA和核心蛋白的表達(dá)，但以上海市人群為對(duì)象的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)HCV在人群感染率約2%，不能確定膽管癌發(fā)生與HCV有關(guān)[4]。一組對(duì)美國(guó)退役軍人的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)[5]，感染HCV的人群罹患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)比是15.09，肝內(nèi)膽管癌的風(fēng)險(xiǎn)比是2.55，但患肝外膽管癌的風(fēng)險(xiǎn)比只有1.50，因此認(rèn)為HCV感染與肝外膽管癌發(fā)生關(guān)系不大。我們?cè)仡櫿{(diào)查天津地區(qū)的肝外膽管癌病例資料發(fā)現(xiàn)[6]，抗HCV陽(yáng)性率在膽管癌患者中為4.3%，在良性膽道疾病中為5.6%，同樣不能明確HCV感染與膽管癌發(fā)生間的相關(guān)性。但值得我們關(guān)注的是，有研究將HCV C基因轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)C蛋白能激活NFκB信號(hào)通路[7]，并能誘導(dǎo)膽管細(xì)胞發(fā)生上皮-間葉樣轉(zhuǎn)化[8]。是否HCV感染與膽管癌發(fā)生有關(guān)是有待繼續(xù)深入探討的問(wèn)題，我們對(duì)收集的14例膽道腫瘤組織行熒光定量PCR檢測(cè)HCV RNA，結(jié)果無(wú)1例陽(yáng)性。在檢測(cè)的11例肝癌和6例肝炎組織中，也僅有2例陽(yáng)性，且陽(yáng)性的標(biāo)本正是來(lái)自血清抗-HCV陽(yáng)性的病例。我們的結(jié)果與另一項(xiàng)研究結(jié)果一致，該研究采用微粒酶免疫分析法檢測(cè)了73例肝門膽管癌、26例遠(yuǎn)端膽管癌患者的抗-HCV，結(jié)果無(wú)1例陽(yáng)性[3]。我們采用目前臨床上常用的、特異性高的熒光定量PCR方法檢測(cè)新鮮提取組織的HCV RNA，遠(yuǎn)較采用原位PCR或RT-PCR方法從石蠟包埋組織檢測(cè)HCV 5’非編碼區(qū)出現(xiàn)的假陽(yáng)性率低，且結(jié)果更可靠。由于易被RNA酶（RNAase）降解，其實(shí)HCV RNA檢測(cè)率很低，極易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。但如果標(biāo)本處理不當(dāng)、操作中污染等因素，又容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。因此，檢測(cè)組織HCV RNA陽(yáng)性時(shí)，一定與血清抗-HCV結(jié)果進(jìn)行比較，必要時(shí)需反復(fù)檢測(cè)，以避免假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果的出現(xiàn)[9]。本組中2例組織HCV RNA陽(yáng)性的病例，其血清抗-HCV陽(yáng)性，進(jìn)一步說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠。由于目前常用的熒光定量PCR方法測(cè)定的基值為500 copies/mL，必將影響到HCV RNA的陽(yáng)性檢出率，這或許就是該法較原位PCR或RT-PCR方法檢出率低的原因之一。HCV RNA檢出率低的另一原因與我國(guó)HCV流行情況有關(guān)。我國(guó)乙型肝炎病毒（HBV）感染流行遠(yuǎn)較HCV廣泛，前者為57.6%，后者僅為3.2%[10]，HBV與肝門部膽管癌發(fā)生間的關(guān)系似乎較HCV密切，我們?cè)肁lu-PCR方法檢測(cè)本組中的10例肝門部膽管癌標(biāo)本中HBV整合情況，發(fā)現(xiàn)近一半的標(biāo)本可檢測(cè)到HBV基因整合[11]。

表2 肝癌和肝硬化組織HCV RNA檢測(cè)情況

總之，從本研究結(jié)果及我們既往流行病調(diào)查結(jié)果看，膽道腫瘤組織內(nèi)HCV抗體和RNA檢出率極低，HCV是否是膽管癌發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素，尚難定論。

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