劉寶生, 谷希樹, 許靜楊, 胡 霞, 孫淑琴, 白義川

(天津市植物保護研究所,天津 300112)

白僵菌Bb08-12菌株生物學研究及其對美國白蛾的致病性

劉寶生, 谷希樹, 許靜楊, 胡 霞, 孫淑琴, 白義川

(天津市植物保護研究所,天津 300112)

對采自美國白蛾僵蟲的蟲生真菌Bb08-12菌株進行了生物學研究及致病性測定。根據(jù)該菌株的形態(tài)特征將其初步鑒定為球孢白僵菌(Beauveriabassiana)。室內測定結果表明:該菌株在26℃恒溫、高濕度下對1齡中期美國白蛾幼蟲具有較強的致病力。107孢子/mL劑量飼毒處理幼蟲72～120 h,幼蟲死亡率可達25.47%～79.32%,120 h的LC50為1.169×106孢子/mL。該菌株在不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)差異明顯。沙氏培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高,10 d產(chǎn)孢量可達到5.59×108孢子/cm2,極顯著高于PSA、查彼培養(yǎng)基和5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量。24 h光照和24 h黑暗兩處理間的菌落生長量差異不明顯,而在培養(yǎng)的最初48 h,24 h黑暗處理可顯著促進分生孢子萌發(fā)。

美國白蛾; 白僵菌生物學特性; 致病性測定

美國白蛾(Hyphantria cuneaDrury)原產(chǎn)于北美,屬鱗翅目燈蛾科(Arctiidae),是國際檢疫性對象。在北緯19°～55°廣大地區(qū)均有分布。主要為害闊葉樹種,嚴重時食光葉片導致整株樹木枯死[1],是我國林業(yè)病蟲害防控的重要對象。從20世紀80年代已經(jīng)開始對美國白蛾生物防治技術基礎與應用展開研究并取得了重大成果[2]。然而利用白僵菌防治美國白蛾的基礎與應用技術研究才剛剛起步,研究報道的文獻不多。2008年12月陸秀君等人報道了對美國白蛾高毒白僵菌菌株的篩選及與化學藥劑相容性研究結果[3]。本文作者對采自天津市美國白蛾幼蟲的白僵菌Bb08-12菌株進行了形態(tài)初步鑒定、生物學特性與致病性測定。現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 菌源

供試菌株為筆者2008年10月采自天津市農(nóng)科院北區(qū)白蠟林地美國白蛾罹病蟲尸。

1.2 培養(yǎng)基

試驗用培養(yǎng)基種類[4-5]如下。

沙氏(SDAY)培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,葡萄糖40 g,酵母膏2 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1 000 mL,調pH為5.6。

查彼(Czapek)培養(yǎng)基:硝酸鈉2.00 g,磷酸二氫鉀1.00 g,氯化鉀0.50 g,硫酸鎂0.50 g,硫酸亞鐵0.01 g,蔗糖 30.00 g,瓊脂粉 17～20 g,蒸餾水1 000 mL。

5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基:50 g麩皮放入1 000 mL水中煮30 min,過濾,補足水量至1 000 mL,然后加入20 g蔗糖、蛋白胨2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂粉18 g,加熱至培養(yǎng)基成分完全溶解后再補充一次水至1 000 mL,過濾、分裝至三角瓶,高壓滅菌備用。

5%麩皮-蔗糖液體培養(yǎng)基:為不含瓊脂粉的5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基配方,制作過程與5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基相同。

1.3 菌種分離、純化

用無菌水沖洗下僵蟲的白色菌粉,配制成菌懸液并充分搖蕩,逐漸稀釋,涂布于沙氏平板滅菌培養(yǎng)基上,26℃下恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)3 d左右,挑取單個微小白色菌落,接入滅菌的試管斜面沙氏培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)菌落占到斜面的2/3時置于低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 形態(tài)學鑒定

采用載玻片直接培養(yǎng)法[6]。培養(yǎng)3 d左右,可觀察到成熟的分生孢子及分生孢子梗,進行顯微測量與照相。

1.5 不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察及菌落生長量測定

菌落形態(tài)觀察:用20 d菌齡的白僵菌菌粉制備懸浮液;用接種針蘸取懸浮液點接于90 mm平板培養(yǎng)基上,置于有人工光照的培養(yǎng)箱內26℃恒溫培養(yǎng)10 d,觀察菌落形態(tài)。

生長量測定:用20 d白僵菌菌粉制備懸浮液。用接種針蘸取懸浮液點接于90 mm平板培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)箱內全暗26℃恒溫培養(yǎng),接菌后第8天采用十字交叉法各測量一次菌落直徑,每處理重復4次,進行方差分析。

產(chǎn)孢量測定按文獻[7]法,計算公式:1 cm2菌落孢子數(shù)量=(平均每個小格孢子數(shù)量×4×106×稀釋倍數(shù))/(3.14×r2×n),r為菌落半徑(cm),n為菌落的數(shù)量(塊)。

1.6 不同光照條件下白僵菌菌落生長量及孢子萌發(fā)的測定

菌落生長量:測定全暗和全光條件下白僵菌Bb08-12菌落的生長速度。用20 d菌齡的白僵菌菌粉制備懸浮液;用接種針蘸取懸浮液點接于沙氏平板培養(yǎng)基中置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內培養(yǎng),第4天開始測量直徑,每個處理8次重復取平均值,并進行方差分析。

孢子萌發(fā)測定:用10 d菌齡的白僵菌菌粉適量放入等量的 5%麩皮-蔗糖液體培養(yǎng)基中,振蕩15 min,置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內,全光、全暗(用紙包裹嚴密)處理。測定培養(yǎng)24、48、72 h的孢子萌發(fā)率,其方法為:在16×40的視野下鏡檢孢子數(shù)量和萌發(fā)的孢子數(shù)量。萌發(fā)標準:芽管長度超過或等于孢子的最小半徑時判定為萌發(fā)。各處理的孢子懸浮液鏡檢前搖勻,每處理隨機測5個視野,每個視野的孢子數(shù)量以40～50個左右為宜,密度大時可在載玻片上加水稀釋。取5次重復平均值,并進行方差分析。

1.7 白僵菌Bb08-12菌株對美國白蛾幼蟲致病性測定

2009年5月21日采集田間白蠟樹葉片上的美國白蛾1齡中期幼蟲,體長5～6 mm。每處理3次重復,每重復20頭左右,待幼蟲取食20 h左右穩(wěn)定后再飼喂帶毒葉片。

白僵菌Bb08-12菌株孢子懸浮液的制備:用沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d的分生孢子粉加0.05%吐溫-80 配成 107、106、105、104、103孢子/mL 5 個濃度梯度,0.05%吐溫-80清水為空白對照。

帶毒葉片飼喂處理:把新鮮白蠟葉片洗凈,靜置30～40 min,風干葉面水分,在不同劑量白僵菌懸浮液中浸濕后陰干葉面水分,即成帶毒葉片。用不同劑量帶毒葉片飼喂備好的美國白蛾幼蟲,每皿20頭左右。培養(yǎng)皿內底層墊3～4層面巾紙,并滴加適量清水(以不能控出水為宜),使培養(yǎng)皿內保持高濕狀態(tài),紙上鋪帶毒白蠟葉片,接入已穩(wěn)定取食的美國白蛾幼蟲,培養(yǎng)皿蓋與底之間加面巾紙密封防幼蟲逃走,然后置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內;每天調查幼蟲死亡情況,逐日調查5 d,適時更換帶毒葉片。

統(tǒng)計各處理和空白對照的逐日幼蟲死亡率,對各處理死亡率進行方差分析。

應用DPS軟件計算毒力回歸方程及 LC50和相關系數(shù)[3]。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定結果

從美國白蛾幼蟲僵尸分離、純化得到編號為Bb08-12的白僵菌菌株,直接鏡檢可見:分生孢子梗單生,呈瓶狀;孢子梗的瓶體形狀從基部顯著膨大到細長瓶形不等(見圖1,圖2)。分生孢子生在“之”字形小梗上(見圖2),多數(shù)為圓球形,少數(shù)卵圓形,無色 、單胞,直徑大小為 1.61～3.18 μ m,平均直徑2.23 μ m。由此形態(tài)特征,根據(jù)文獻[7-8,10]初步鑒定為真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、白僵菌屬、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。

2.2 不同培養(yǎng)基上菌落形態(tài)觀察及菌落生長量、產(chǎn)孢量的測定

2.2.1 不同培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)

白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)不同,其各自特點見表1。

表1 白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.2.2 白僵菌Bb08-12菌株在不同培養(yǎng)基上生長量及產(chǎn)孢量

從表2結果看出:該菌株菌落生長量在4種培養(yǎng)基上有顯著和極顯著差異。菌落在PSA培養(yǎng)基上生長極顯著快于沙氏培養(yǎng)基上,顯著快于5%麩皮-蔗糖培養(yǎng)基,但與5%麩皮-蔗糖和查彼培養(yǎng)基相比無極顯著差異;在查彼(Czapek)培養(yǎng)基和5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基上菌落生長量差異不顯著。

產(chǎn)孢量測定結果表明,在沙氏培養(yǎng)基上該菌株產(chǎn)孢量極顯著高于其他3個培養(yǎng)基,而這3個培養(yǎng)基之間的產(chǎn)孢量沒有極顯著差異。其次,5%麩皮-蔗糖固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量顯著高于查彼(Czapek),但與PSA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量相比無顯著差異;PSA培養(yǎng)基和查彼的產(chǎn)孢量無顯著差異。

表2 白僵菌Bb08-12在不同固體培養(yǎng)基培養(yǎng)8 d菌落生長量及10 d產(chǎn)孢量

2.3 不同光照條件下Bb08-12菌株菌落生長量及孢子萌發(fā)率

表3結果表明:不同光照條件對白僵菌菌落生長沒有顯著影響。在培養(yǎng)的最初24、48 h,全黑暗條件下白僵菌分生孢子萌發(fā)率(分別為47.10%,83.36%)顯著高于全光條件下相應處理(26.01%,61.46%);培養(yǎng)至72 h,全光和全黑暗條件下分生孢子萌發(fā)率不再有顯著差異。由此表明,在最初培養(yǎng)48 h內,全黑暗較全光條件可顯著促進白僵菌分生孢子的萌發(fā)。

表3 不同光照條件下白僵菌Bb08-12菌株菌落生長量和分生孢子萌發(fā)率1)

2.4 白僵菌Bb08-12菌株對美國白蛾幼蟲的致病性

從表4結果看出,白僵菌對美國白蛾幼蟲的致病死亡率隨孢子懸浮液中孢子含量和持續(xù)時間而增加。飼毒處理后的72～120 h,幼蟲死亡率顯著提高。在 26℃恒溫、皿內高濕度下,球孢白僵菌Bb08-12菌株在107孢子/mL劑量下,對1齡中期美國白蛾幼蟲120 h的毒力回歸方程、LC50和相關系數(shù)R分別為y=0.516 7x+1.865 1、1.169×106孢子/mL和0.947 3。

表4 白僵菌Bb08-12菌株對美國白蛾幼蟲致病性測定結果1)

3 討論

本文對白僵菌Bb08-12菌株進行了形態(tài)學鑒定,球孢白僵菌僅為初步結果。后續(xù)研究中將采用核酸序列分析進行分子鑒定。

林華峰等人[5]研究證明,濕度是白僵菌孢子萌發(fā)和侵染致病的主要制約因子。在溫度達10℃以上,相對濕度達95%時白僵菌對松毛蟲的侵染致病效應更為顯著。因此,本研究致病性測定中,采用1.7方法使皿內小環(huán)境在26℃恒溫下維持高濕狀態(tài),因條件所限未能測定相對濕度數(shù)值。

沙氏培養(yǎng)基是目前保存和培養(yǎng)白僵菌最常用的培養(yǎng)基[6],本研究結果也證明該培養(yǎng)基有利于白僵菌產(chǎn)孢,此結果與李會平研究結果[8]不同,是否與所用白僵菌菌株有關,有待研究。此外,本研究發(fā)現(xiàn),在最初培養(yǎng)的48 h內,黑暗處理的分生孢子萌發(fā)率顯著高于光照處理的萌發(fā)率;隨培養(yǎng)時間延長,黑暗處理與光照處理的萌發(fā)率差異不再顯著。這與李會平研究結果是一致的,進一步證明了黑暗處理能夠促進白僵菌分生孢子的萌發(fā)[9],為白僵菌生產(chǎn)中培養(yǎng)液體菌種、優(yōu)化發(fā)酵條件提供了依據(jù)。

[1]劉代文,李紅,段學慧.天津地區(qū)美國白蛾的生活習性及生物防治[J].天津農(nóng)業(yè)科學,2005,11(1):40-42.

[2]張彥龍,武三安,郭文霞,等.中國美國白蛾生物防治研究進展[J].河北林果研究,2008,23(1):70-77.

[3]陸秀君,李瑞軍,董立新,等.美國白蛾高毒白僵菌菌株篩選與高效氯氰菊酯的相容性[J].植物保護學報,2008,35(6):575-576.

[4]方中達.植病研究方法[M].北京:農(nóng)業(yè)出版社,1998.

[5]林華峰,樊美珍,李增智,等.不同溫濕度下白僵菌對松毛蟲的侵染致病效應[J].應用生態(tài)學報,1998,9(2):195-200.

[6]陳聲明,張立欽.微生物學研究技術[M].北京:科學出版社,2006.

[7]幸興球.白僵菌的調查和鑒定[J].昆蟲知識,1976,13(3):183-174.

[8]路國兵,王更先,韓景瑞,等.白僵菌菌株的分離鑒定及生物學特性研究[J].中國蠶業(yè),2007,28(2):13-15,32.

[9]李會平.桑天牛幼蟲高致病性白僵菌菌株篩選及其致病機理研究[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2007.

[10]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1979.

Biological characteristics and pathogenicity of Beauveria bassiana Bb08-12 to Hyphantria cunea larvae

Liu Baosheng, Gu Xishu, Xu Jingyang, Hu Xia, Sun Shuqin,Bai Yichuan
(Tianjin Institute of Plant Protection,Tianjin300112,China)

Biological characteristics and pathogenicity of the entomogenous fungi Bb08-12,isolated fromHyphantria cunealarvae,toH.cuneawere investigated in this study.The strain Bb08-12 was primarily identified asBeauveria bassianaaccording to its morphology.The results showed that the strain Bb08-12 had stronger pathogenicity toH.cuneaat higher humidity and constant temperature(26℃)in the laboratory.WhenH.cunealarvae were fed with leaves containing1×107spores/mL,the 25.47%-79.32%larvae were killed after 72-120 h.The LC50was 1.169×106spores/mL at 120 h.The colony forms ofB.bassianaBb08-12 were remarkably different on different culture media.The number of conidia on SDAY culture medium was the highest,reaching to 5.59×108spores/cm2in 10 days,which was significantly greater than that on PSA,Czapek and 5%bran-sucrose culture media.The growth rates of colonies were not remarkably different between 24 h-light and 24 h-darkness.Conidia germination was significantly improved in 24 h-darkness in the initial 48 h.

Hyphantria cunea; biological characteristic ofBeauveria bassiana; pathogenicity determination

S 476.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2011.04.032

2010-07-02

2010-09-28

天津農(nóng)科院院長基金(09004)

聯(lián)系方式 E-mail:13207529650@163.com