鄭培實(shí)，張 陽(yáng)，蔣 葵，戴朝霞，徐麗葉，方立萍，丁曉蕾

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116027)

肝癌是常見(jiàn)惡性腫瘤，近年來(lái)病死率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)于晚期肝癌，缺少有效的藥物治療方案［1］。2010年3～10月，我們觀察了華蟾素對(duì)離體肝癌細(xì)胞株SMMC-7721增殖、凋亡的影響，旨在為肝癌的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫(kù));華蟾素注射劑(安徽金蟾制藥廠);Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2孵箱，使用10%胎牛血清(57℃滅活30 min)、青鏈霉素各100 U/ml的RPMI1640培養(yǎng)液。細(xì)胞為上皮樣貼壁細(xì)胞，每3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。

1.2.2 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞接種于96孔板，密度為7×103/孔，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入0.4、0.6、0.8 μmol/L華蟾素，每藥物濃度各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組不加藥。加藥后分別培養(yǎng)24、48 h后，各孔加5%四氮唑藍(lán)液10 μl，孵育4 h，洗滌后各孔加二甲亞砜200 μl，充分混勻溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處各孔的D值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率(%)=(對(duì)照組D570值 -實(shí)驗(yàn)組 D570值)/對(duì)照組 D570值 ×100%。

1.2.3 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMMC-7721細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組加入華蟾素，使其終濃度為0.6 μmol/L，對(duì)照組不加藥。離心去培養(yǎng)基，PBS洗滌后，采用Annexin V-FITV/PI雙標(biāo)記的流式細(xì)胞術(shù)避光室溫標(biāo)記30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 華蟾素干預(yù)及細(xì)胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3 mRNA檢測(cè) 分組及干預(yù)同1.2.3，藥物作用48 h后收集5×106/ml細(xì)胞于離心管中，離心去上清液;加入Trizol試劑，按說(shuō)明書(shū)操作步驟提取RNA。采用RT-PCR法(凱基公司的RT-PCR反應(yīng)體系)檢測(cè)Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 華蟾素干預(yù)及測(cè)Mcl-1蛋白檢測(cè) 采用Western blot法。分組及干預(yù)同1.2.3。藥物作用48 h后收集細(xì)胞提取總蛋白。以tubulin為內(nèi)參照，結(jié)果用Leica Qwin圖像分析軟件分析條帶光密度積分值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖抑制率 見(jiàn)表1。

表1 兩組細(xì)胞增殖抑制率比較(%)

2.2 細(xì)胞周期及凋亡率 見(jiàn)表2。

表2 兩組細(xì)胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

表2 兩組細(xì)胞周期所占比例及凋亡率比較(%，)

注:與對(duì)照組比較，*P ＜0.05

組別 G0～G1期 G2～M期 S 期 凋亡率實(shí)驗(yàn)組 55.53 ±0.75 1.32 ±0.19 41.54 ±0.5417.26 ±0.89*對(duì)照組63.21 ±1.2410.21 ±0.13 24.33 ±1.453.21 ±0.43

2.3 Caspase-3 mRNA及Mcl-1蛋白表達(dá) 華蟾素作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA分別為(0.54±0.10)%、(0.32 ±0.11)%，P ＜0.05;Mcl-1 蛋白分別為(0.60 ±0.14)%、(0.95 ±0.11)%，P ＜0.05。

3 討論

蟾蜍治療腫瘤有著悠久的歷史和豐富的文獻(xiàn)記載，目前用于多種腫瘤［2，3］，有研究提示其可能通過(guò)干預(yù)FAS通路發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。但其在Mcl-1為中心的凋亡通路中發(fā)揮的作用尚不明確。本研究實(shí)驗(yàn)組增殖抑制率明顯高于對(duì)照組，且呈時(shí)間和劑量依賴性，提示華蟾素作用于SMMC-7721離體細(xì)胞，可抑制其增殖，并且誘導(dǎo)其凋亡。

Caspase是一個(gè)含有半胱氨酸活性的胞質(zhì)蛋白酶家族，迄今至少發(fā)現(xiàn)14個(gè)成員。Caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡過(guò)程中激活的關(guān)鍵酶，也是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)分子［5］。其作用之一是參與Mcl-1蛋白的降解［6，7］，而后者通過(guò)特定信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，其過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞生存，可引起在人類的造血系統(tǒng)的腫瘤以及多種實(shí)體瘤，其亦是腫瘤對(duì)傳統(tǒng)的治療耐藥的一個(gè)關(guān)鍵因素。Mcl-1即髓系白血病基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化過(guò)程中是一個(gè)必要的抗凋亡因子，調(diào)節(jié)其表達(dá)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)調(diào)節(jié)紊亂都會(huì)引起Mcl-1的過(guò)度表達(dá)，從而導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)人類一些疾病的發(fā)生。Mcl-1過(guò)表達(dá)可引起包括肝癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤［8］，并且是腫瘤對(duì)傳統(tǒng)的治療耐藥的一個(gè)關(guān)鍵因素［9］。

本研究實(shí)驗(yàn)組Caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，Mcl-1蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明華蟾素對(duì)SMMC-7721離體肝癌細(xì)胞具有增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用，其機(jī)理可能為使Caspase-3表達(dá)升高、Mcl-1表達(dá)降低。本研究為華蟾素治療肝癌提供了更深入的理論依據(jù)。

［1］Wang JH，Changchien CS，Hu TH，et al.The efficacy of treatment schedules according to Barcelona Clinic Liver Cancer staging for hepatocellular carcinoma-Survival analysis of 3892 patients［J］.Eur J Cancer，2008，44(7):1000-1006.

［2］王焰，李軍民，楊晨敏，等.華蟾素誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制［J］.腫瘤，2005，25(6):534-537.

［3］張靜.華蟾素聯(lián)合化療治療晚期惡性腫瘤的療效分析［J］.腫瘤，2000，20(5):379-381.

［4］張莉.華蟾素誘導(dǎo) U937細(xì)胞凋亡及其作用機(jī)制［J］.腫瘤，2007，27(5):341-344.

［5］王新艷，李玉華，朱謚豢，等.卵巢癌組織KLKⅡ基因的表達(dá)意義［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(22):2023-2025.

［6］Derouet M，Thomas L.Granulocyte macrophage colony-stimulating factor signaling and proteasome inhibition delay neutrophil apoptosis by increasing the stability of Mcl-1［J］.J Biol Chem，2004，279(26):26915.

［7］Weng C，Li Y.Specific cleavage of Mcl-1 by caspase-3 in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis in Jurkat leukemia T cells［J］.J Biol Chem，2005，280(11):1049.

［8］Derenne S，Monia B.Antisense strategy shows that Mcl-1 rather than Bcl-2 or Bcl-x(L)is an essential survival protein of human myeloma cells［J］.Blood，2002，100(1):194.

［9］Hussain SA，Cheney CM.Mcl-1 is a relevant therapeutic target in acute and chronic lymphoid malignancies:down-regulation enhances rituximab mediated apoptosis and complement-dependent cytotoxicity［J］.Clin Cancer Res，2007，13(7):2144.