吳曉薇 ，徐成剛 ，馬保華 ，江經(jīng)緯 ，葉賀佳 ，區(qū)燕宜 ，徐小芹 ，廖 明

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623；3.廣東省動(dòng)物源性人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510642；4.南海出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東佛山 528200）

單增李斯特菌是典型的胞內(nèi)寄生菌，其感染過程包括內(nèi)化、逃避液泡、吞噬、肌動(dòng)纖維聚集和細(xì)胞傳播等階段，與各個(gè)階段有關(guān)的毒力因子分別是InlA、hly、actA和plcB[7]。Hly基因是致病性李斯特氏菌重要的的毒力基因，hly基因編碼形成李斯特菌溶血素O（Listeriolysin O，LLO）。目前的研究表明，LLO是一個(gè)多功能毒力因子，能引起宿主細(xì)胞多種反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、黏膜細(xì)胞外滲作用、巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的表達(dá)、樹突狀細(xì)胞的凋亡、磷脂代謝及引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)等等[8-10]。LLO 是一種穿孔毒素，能損傷紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、裂解溶酶體膜和吞噬體膜，使細(xì)菌能夠逃離噬菌體，從而逃避吞噬體中殺菌物質(zhì)的殺滅，進(jìn)入胞漿后在胞漿中復(fù)制。溶解素是細(xì)菌在胞液內(nèi)繁殖的先決條件，其缺失將使細(xì)菌毒力全部喪失。不產(chǎn)生LLO的突變株雖可在非吞噬細(xì)胞的胞液中生存一段時(shí)間，但卻不能繁殖，并因無法逃逸吞噬體而不能感染其他細(xì)胞。單增李斯特菌感染鼠脾臟和骨髓的樹突狀細(xì)胞后可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡；不產(chǎn)生LLO的李斯特菌突變體不能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而提純的LLO則可引起這種程序性控制的細(xì)胞死亡[8]。溶解素還在感染細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)和定向免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[7]，它能夠促進(jìn)MHC-I類分子限制性免疫應(yīng)答，增強(qiáng)保護(hù)性抗原的免疫作用[11]。由于LLO 所具有的獨(dú)特生物學(xué)特性，已被用于構(gòu)建各種減毒疫苗或核酸疫苗。LLO還可能成為一種新型的純化蛋白抗原、脂質(zhì)體、減毒菌株和DNA疫苗的遞送工具[12]。

本研究旨在克隆和表達(dá)單增李斯特菌的Hly基因，探索大量制備溶解素蛋白的方法，為進(jìn)一步研制基于溶解素蛋白的診斷抗原和特異性單克隆抗體，開展LM的致病與免疫機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、酶及主要試劑

單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)菌株LM-C53005購自中國藥品生物制品監(jiān)察所；菌株C53005為中國藥品生物制品檢定所購買，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室保存；克隆載體質(zhì)粒pMD18-T為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a、克隆菌DH5α 和 E.coli BL21（DE3）為 Novagen公司產(chǎn)品；Taq酶、各限制性內(nèi)切酶及其他工具酶均為TaKaRa公司產(chǎn)品；Gel Extraction Kit、Plasmid Mini Kit I為OMEGA公司產(chǎn)品；丙烯酰胺（Acrylamide）、N-N'-亞甲叉雙丙烯酰胺（Bisacrylamide）和瓊脂粉為廣州展晨生物技術(shù)公司產(chǎn)品；TEMED、過硫酸銨和IPTG為華美生物工程公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；兔抗單增李斯特菌血清由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究室制備提供。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參考GenBank收錄的單增李斯特菌Hly基因序列，使用 DNAstar（5.07版）和 Primer Premier（5.0版）軟件進(jìn)行分析，針對Hly基因的開放閱讀框架（ORF）中不含信號(hào)肽編碼序列的區(qū)域設(shè)計(jì)一對引物Hly1和Hly2，并分別在引物的5'端引入限制性內(nèi)切酶BamHI和Xhol I的識(shí)別位點(diǎn)（下劃線表示）。預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物跨幅為1515 bp。

Hly1：5'－GGATCCGATGCATCTGCATTCAAT AAAGA－3'，

Hly2：5'－GCGCCTCGAGTTATTCGATTGGAT TATCTAC－3'

引物送上海生物工程有限公司合成，用DEPC處理過的去離子水稀釋為25 pmol/μL備用。

1.3 菌株DNA的提取

參照上海生工生物工程公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒使用說明書進(jìn)行。將菌株進(jìn)行增菌培養(yǎng)，達(dá)到約109CFU/mL，10000 r/min離心1 min，去掉培養(yǎng)液。加入200 μL有溶菌酶的TE溶液，用移液器槍頭混勻。在室溫下酶解 8 min。加入 400 μL的Digestion Buffer，混勻；加入 3 μL 蛋白酶 K，混勻。在55℃的水浴保溫5 min。加入260 μL無水乙醇，混勻，全部轉(zhuǎn)移到套放于2 mL集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，8000 r/min離心1 min，棄去濾液，UNIQ-10柱用洗脫緩沖液洗滌三次；最后用40 μL洗脫緩沖液洗脫核酸，放置－20℃保存。

當(dāng)t>x(0)/D0(x(0) m1(2D0t)-2β,則存在T2=max(T1,x(0)/D0),當(dāng)t>T2時(shí),有E(a)>m2t-2β,其中m2=m1(2D0)-2β。另外，因?yàn)閍(t)<1,有a2(t)

1.4 Hly基因片段的擴(kuò)增

以提取LM DNA作為模板，用引物Hly1和Hly2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，循環(huán) 30次；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。然后用小量凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1.5 Hly基因的克隆與序列測定

參照pMD18-T載體的使用說明進(jìn)行，將純化的Hly基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，挑取白色菌落，用小量質(zhì)粒提取試劑盒質(zhì)粒DNA，陽性質(zhì)粒命名為pMD18-T-sHly，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，酶切鑒定及測序。所測序列與GenBank收錄的單增李斯特菌Hly基因序列進(jìn)行BLAST比對。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

用BamHI和XholI分別雙酶切重組表達(dá)質(zhì)粒pMD18-T-sHly和pET-28a載體，產(chǎn)生相匹配的黏性末端，然后回收目的片段和載體片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-sHly。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，用小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒DNA，對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定。

1.7 Hly基因表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將轉(zhuǎn)入pET-28a-Hly和pET-28a空載體的大腸桿菌BL21（DE3）分別接種于LB培養(yǎng)液后，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約等于0.5時(shí)，無菌條件下取1 mL菌液作為陰性對照。然后向剩余的培養(yǎng)液中加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，無菌條件下取1 mL菌液樣本，10000 r/min離心1 min，取沉淀按照汪家政（2006）[13]的報(bào)道進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

1.8 表達(dá)產(chǎn)物的純化

將攜帶表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hly的大腸桿菌BL21（DE3）接種于液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約等于0.5時(shí)，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)6 h，將菌體冷凍離心后棄上清，并重懸于細(xì)菌裂解緩沖液中超聲裂解，表達(dá)產(chǎn)物作SDS-PAGE分析。12000 r/min離心后收集沉淀重懸于結(jié)合緩沖液中冰浴1 h，過Histrap Ni2+柱（Pharmacia），收集用洗脫緩沖液洗脫下的重組蛋白。

1.9 純化蛋白的Western Blot分析

表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，以兔抗單增李斯特菌血清為一抗，羊抗兔IgG-HRP標(biāo)記抗體為二抗，進(jìn)行Western Blot檢測。

1.10 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析

將1.4獲得的攜帶表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hly的重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，取100 mL培養(yǎng)液，4℃8000 r/min離心15 min，棄上清液；沉淀物用10 mL結(jié)合緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH7.6，20 mmol/L咪唑，0.5 mmol/LNaCl）重懸；超聲裂解（60 W，2 min/次）10 min；將裂解物于4℃8000 r/min離心15 min，分別取適量上清和沉淀物按照1.7、1.9的方法進(jìn)行SDSPAGE和Western Blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hly基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

用引物Hly1/Hly2進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到約1500 bp特異性條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-sHly的PCR檢測、酶切鑒定及序列測定

將Hly基因PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進(jìn)行連接（圖2）。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定（圖3），并進(jìn)行序列測定。

2.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定、PCR檢測及序列測定

用BamHI和XholI分別雙酶切pMD18-T-sHly和pET-28a，經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-sHly。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及酶切鑒定。重組質(zhì)粒pET-28a-Hly用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切可以得到2690 bp左右的載體條帶和1590 bp左右的目的條帶，其大小分別與表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a及sHly基因PCR產(chǎn)物的大小一致（圖4、5）。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

如圖6所示，攜帶表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hly的大腸桿菌 BL21（DE3）經(jīng) IPTG（1mmol/L）誘導(dǎo)后，在 65 kU處形成一條特異的條帶。

2.5 表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting鑒定

經(jīng)Western-blotting鑒定可以得知，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物可被兔抗LM陽性血清特異識(shí)別，如圖7所示。表明單增李斯特菌的Hly基因在大腸桿菌BL21（DE3）中得到正確表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)根據(jù) GeneBank發(fā)表的LM的Hly全基因的末端保守序列設(shè)計(jì)游引物，采用 PCR方法擴(kuò)增出標(biāo)準(zhǔn)株C53005溶血素基因，將其克隆到pMD18-T載體中，篩選帶有插入片段的陽性質(zhì)粒。經(jīng)酶切和PCR鑒定，然后進(jìn)行測序。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)株C53005株Hly基因全長1590 bp，含有完整的開放閱讀框架，編碼529個(gè)氨基酸。其核苷酸序列與報(bào)道的EF183456和EQ8447148序列同源性分別為97.0%和99.9%，將其推導(dǎo)的氨基酸序列與報(bào)道的EF183456和EQ8447148序列推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分別為98.0%和99.8%。

本研究以LM標(biāo)準(zhǔn)菌株LM-C53005為材料，克隆了不含信號(hào)肽編碼區(qū)域的HlyA基因ORF部分，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Hly。成功的構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒后，誘導(dǎo)表達(dá)條件就直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。誘導(dǎo)表達(dá)條件（如表達(dá)菌株、IPTG誘導(dǎo)濃度、大腸桿菌被誘導(dǎo)時(shí)所處的狀態(tài)、誘導(dǎo)時(shí)間長短等）對于蛋白質(zhì)的原核表達(dá)非常重要，本實(shí)驗(yàn)摸索了培養(yǎng)液中卡那霉素最佳濃度、培養(yǎng)液中的pH值、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)前的菌液狀態(tài)、IPTG濃度等，結(jié)果證實(shí)：37℃培養(yǎng)，IPTG的終濃度1.0 mmol/L，誘導(dǎo)前的菌液OD600約為0.6，誘導(dǎo)時(shí)間約為5 h即可以得到較大表達(dá)蛋白的量。構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中誘導(dǎo)成功表達(dá)HlyA基因。經(jīng)Western-blotting鑒定，該蛋白具有良好的免疫學(xué)活性。

Hly基因編碼529個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約為58 kU。由計(jì)算得知，Hly基因表達(dá)的融合蛋白理論值應(yīng)約為65 kU（表達(dá)載體pET-28a（+）的下游含有6個(gè)組氨酸（6×His）的純化標(biāo)簽，重組蛋白融合著此6個(gè)組氨酸大小為6 kU）。SDS－PAGE分析結(jié)果表明：IPTG誘導(dǎo)后重組菌pET-sHly產(chǎn)生一條約60 kU的蛋白條。在 Western-blotting實(shí)驗(yàn)中用一抗是由本實(shí)驗(yàn)是自制的，采用LM的滅活苗三次免疫兔制備的多克隆抗體。經(jīng)Western-blotting分析表明，表達(dá)的約60 kU重組蛋白處與LM全菌體免疫動(dòng)物制備的多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，表明此重組融合蛋白與天然的LM溶血素蛋白一樣都具有良好的抗原反應(yīng)性。同時(shí)純化后的Hly蛋白經(jīng)Western-blotting分析表明，表達(dá)的重組蛋白帶具有正常的反應(yīng)原性。這說明重組蛋白可作為良好診斷抗原，也為單核細(xì)胞增生性李斯特菌快速診斷方法的建立提供了條件，為今后研制分子診斷試劑提供了科學(xué)的理論依據(jù)。另外，一抗、二抗?jié)舛燃胺磻?yīng)條件也會(huì)直接影響Western-blotting特異蛋白帶出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過用Dot-ELISA的方法進(jìn)行一抗、二抗?jié)舛鹊拿鞯牡玫揭豢節(jié)舛?:50，二抗?jié)舛葹?:1000。由于LM溶解素蛋白在單核細(xì)胞增生性李斯特菌的致病和免疫方面也起著重要的作用，LLO蛋白的原核表達(dá)及其大量制備方法的探討也為進(jìn)一步開展LM的致病機(jī)理與免疫機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)。

[1]Bhasin S K，Chaturvedi S，Sharma A K，et al.Knowledge amongst adult population regarding vectors of malaria in 21 states of India[J].J Commun Dis，2001，33（4）：286-296.

[2]Gugnani H C.Some emerging food and water borne pathogens[J].J Commun Dis，1999，31（2）：65-72.

[3]Nightingale K K，Windham K，Wiedmann M.Evolution and molecular phylogeny of Listeria monocytogenes isolated from human and animal listeriosis cases and foods[J].J Bacteriol，2005，187（16）：5537-5551.

[4]Ryser T，Elmer H M.Listeriosis and Food Safety[J].Marcel Dekke Inc，1991，6（2）：214-216.

[5]梁銳萍，黃素珍，胡慧強(qiáng).單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌及其檢驗(yàn)[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2004，21（11）：48-49.

[6]Gedde M M，Higgins D E，Tilney L G，et al.Role of listeriolysin O in cell-to-cell spread of Listeria monocytogenes[J].Infect Immun，2000，68（2）：999-1003.

[7]江玲麗，陳健舜，方維煥.單核細(xì)胞增多性李斯特菌主要毒力因子研究進(jìn)展 ［J］. 中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（7）：733-736.

[8]Guzman C A，Domann E，Rohde M，et al.Apoptosis of mouse dendritic cells is triggered by listeriolysin，the major virulence determinant of Listeria monocytogenes［J］.Mol Microbiol，1996，20（1）：119-126.

[9]Decatur A L，Portney D A.A PEST-Like sequence in Listeriolysin O essential for Listeria monocytogene pathogenicity［J］.Science，2000，290（5493）：992-995.

[10]Shaynoor D，Pascale C.Listeriolysin O：genuine cytolysis optimized for an intracellular parasite ［J］.The Journal of Cell Biology，2002，156（6）：943-946.

[11]王彬，倪宏波.單核細(xì)胞增生李斯特菌毒力因子研究進(jìn)展［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20（2）：62-67.

[12]殷月蘭，焦新安，潘志明，等.李斯特菌溶血素基因的原核表達(dá)及其生物學(xué)特性[J].微生物學(xué)報(bào)，2004，44（6）：751-755.

[13]汪家政，范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2000.