徐武杰,潘魯青＊＊,岳 峰,李 健

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹消化酶活力的影響

徐武杰1,潘魯青1＊＊,岳 峰1,李 健2

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東青島266071)

以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)為研究對(duì)象,研究氨氮脅迫對(duì)中腸腺、胃、腸組織消化酶活力的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)照組(自然海水)、1、5、20 mg/L處理組,分別于氨氮脅迫后0、6、12、24、48 h取樣進(jìn)行消化酶活力的測(cè)定。結(jié)果表明:氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力影響顯著(P<0.05),而對(duì)照組無(wú)明顯變化。各處理組3種消化器官中類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)呈峰值變化,其中3種消化器官中類(lèi)胰蛋白酶活力在48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平,而中腸腺胃蛋白酶活力在24 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān),胃和腸的胃蛋白酶活力分別于48和24 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。各處理組中腸腺和胃的脂肪酶活力在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,24 h后中腸腺中脂肪酶活力趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān),而胃中脂肪酶活力逐漸下降,至48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。各處理組中腸腺和腸的淀粉酶活力在12 h內(nèi)呈逐漸下降趨勢(shì),12 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯負(fù)相關(guān);各處理組胃的淀粉酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),24 h后趨于穩(wěn)定。同時(shí)在氨氮脅迫48 h時(shí),對(duì)中腸腺和胃的胃蛋白酶、脂肪酶活力均表現(xiàn)為明顯的誘導(dǎo)作用,而對(duì)3種消化器官中淀粉酶活力表現(xiàn)為明顯的抑制作用。由此說(shuō)明,三疣梭子蟹在氨氮脅迫下中腸腺中胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官中淀粉酶活力可作為消化吸收能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

氨氮脅迫;三疣梭子蟹;消化酶活力

氨氮是養(yǎng)殖水環(huán)境中重要的污染脅迫因子,它不僅能直接損害甲殼動(dòng)物的器官組織[1-2],并能滲入血淋巴中產(chǎn)生毒害作用[3],嚴(yán)重影響甲殼動(dòng)物的生理代謝功能[4-8]。三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)屬大型底棲蟹類(lèi),是我國(guó)沿海重要的養(yǎng)殖種類(lèi),在養(yǎng)殖過(guò)程中主要以投喂新鮮的小雜魚(yú)蝦為主,易污染水質(zhì),近年來(lái)由于養(yǎng)殖密度加大、投食過(guò)多,積累的殘餌、代謝廢物等有機(jī)物在微生物的氨化作用下不斷形成氨氮,導(dǎo)致氨氮濃度逐漸增大,已成為三疣梭子蟹生長(zhǎng)、存活的重要脅迫因子。甲殼動(dòng)物中腸腺是主要的消化和解毒代謝器官,已有研究表明甲殼動(dòng)物在氨氮脅迫下中腸腺通過(guò)分泌大量的解毒代謝酶類(lèi)來(lái)降低氨氮的毒害作用[8-10],同時(shí)氨氮脅迫也引起中腸腺細(xì)胞組成、數(shù)量發(fā)生變化,對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷效應(yīng),嚴(yán)重影響了消化酶分泌等生理功能[1,11]。動(dòng)物消化酶活力的高低直接反映了其對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收利用的能力,從而決定動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育的速度,目前有關(guān)氨氮對(duì)甲殼動(dòng)物消化酶活力的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究了氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹消化器官中類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力的影響,探討了氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹消化生理的影響機(jī)制,旨在篩選三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化吸收能力的評(píng)價(jià)指標(biāo),為三疣梭子蟹健康養(yǎng)殖的水環(huán)境管理技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用三疣梭子蟹購(gòu)自青島市沙子口碼頭,全甲寬為(12.2±0.58)cm,甲長(zhǎng)為(5.7±0.19)cm,體質(zhì)量為(104.8±9.6)g,體色正常,健康活潑。實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)10 d,海水鹽度為31,p H=8.2,溫度為(15± 0.5)℃,氨氮為(0.08±0.02)mg·L-1,連續(xù)充氣,日換水2次,換水量為1/2～2/3,并按體質(zhì)量的10%投喂新鮮的菲律賓蛤仔。

1.2 實(shí)驗(yàn)梯度設(shè)置

根據(jù)Chen和鐘碩良等[12-13]測(cè)定海水養(yǎng)殖池塘底層水的氨氮濃度分別為0～46 mg·L-1和0.01～29.3 mg·L-1,實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)氨氮梯度,分別為0(對(duì)照組,自然海水)、1、5、20 mg·L-1,各梯度采用10 g·L-1的氯化銨溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)在136 cm×90 cm×70 cm的塑料水槽內(nèi)進(jìn)行,將暫養(yǎng)在自然海水中健康的三疣梭子蟹饑餓48 h后,隨機(jī)移入各實(shí)驗(yàn)梯度中,每個(gè)水槽分別放三疣梭子蟹15只,每個(gè)梯度均設(shè)3個(gè)平行組,實(shí)驗(yàn)期間不投喂餌料,并且養(yǎng)殖管理與暫養(yǎng)期間完全相同,換水時(shí)分別加入相應(yīng)氨氮濃度的養(yǎng)殖用水。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每隔6 h采用次溴酸鹽氧化法[14]測(cè)定1次氨氮濃度,實(shí)測(cè)值分別為(0.08±0.01)、(1.20± 0.08)、(5.37±0.10)、(21.26±0.35)mg·L-1。實(shí)驗(yàn)期間三疣梭子蟹無(wú)死亡現(xiàn)象,取樣時(shí)間為0、6、12、24和48 h。

1.3 樣品的采集與制備

每個(gè)水槽隨機(jī)取3只蟹,置冰盤(pán)內(nèi)解剖,取出完整的中腸腺、胃和腸,分別剪開(kāi)胃和腸,用預(yù)冷超純水(0～4℃,p H=6.8)將內(nèi)容物沖洗掉,用濾紙輕輕吸干水分,分別保存于-80℃冰箱中。

分別取濕質(zhì)量為100 mg左右的中腸腺、胃、腸樣品,加入10倍體積(質(zhì)量濃度)預(yù)冷超純水,置于冰浴中用勻漿機(jī)以轉(zhuǎn)速10 000 r/min勻漿5 min,取部分勻漿液直接用于測(cè)定脂肪酶活力,其余勻漿液用高速冷凍離心機(jī)(0～1℃)以10 000 r/min離心30 min,取上清液用于類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶活力的測(cè)定。

1.4 酶活力的測(cè)定

類(lèi)胰蛋白酶和胃蛋白酶活力測(cè)定:參照文獻(xiàn)[15]的方法。加入以0.2 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(p H= 8.4)配置的0.5%酪蛋白2.0 mL,0.04 mol·L-1EDTA-Na20.1 mL,酶液0.4 mL,并加入超純水0.5 mL,使總體積為3.0 mL,混勻,置于55℃水浴中反應(yīng)15 min,然后加入30%三氯醋酸1.0 mL終止反應(yīng);離心(0～1℃,3 000 r/min)15 min,取上清液1 mL,加入0.55 mol·L-1碳酸鈉溶液2.5 mL,再加入福林試劑0.5 mL,37℃水浴中顯色15 min,在680 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(O.D.)值,得生成酪氨酸質(zhì)量。類(lèi)胰蛋白酶活力定義為:在55℃下,每分鐘水解酪蛋白所產(chǎn)生的1μg酪氨酸作為1個(gè)酶活力單位U(μg/min)。

胃蛋白酶活力測(cè)定基本上同類(lèi)胰蛋白酶,所用緩沖液改為0.2 mol·L-1檸檬酸緩沖液(p H=3.0)。

脂肪酶活力測(cè)定:參考文獻(xiàn)[16]的方法并作適當(dāng)改進(jìn)。取1.5 mL 0.066 7 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(p H=7.38)和0.5 mL橄欖油,放入37℃水浴恒溫磁力攪拌器中預(yù)熱5 min,加入0.5 mL酶液,磁力攪拌10 min,立即加入4 mL甲苯,繼續(xù)攪拌2 min,終止反應(yīng);然后在4 000 r/min下離心10 min,取上層有機(jī)相2 mL于小錐形瓶中,加入5%(質(zhì)量濃度)醋酸銅溶液0.5 mL,磁力攪拌3 min,4 000 r/min下離心10 min,取上層含有綠色脂肪酸銅的甲苯溶液,在710 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(O.D.)值,并計(jì)算脂肪酸濃度。脂肪酶活力單位定義為:在37℃下,每分鐘催化橄欖油釋放出1μmol脂肪酸作為1個(gè)酶活力單位U(μmol/min)。按下式計(jì)算酶活力:

X=(c·V)/(t·V′)

式中:X為脂肪酶活力(U),c為脂肪酸濃度(μmol·mL-1),V為脂肪酸萃取液的體積(mL),V′為酶液的用量(mL);t為作用時(shí)間(min)。

淀粉酶活力測(cè)定:參照文獻(xiàn)[15]的方法。加入用0.066 7 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(p H=7.5)配制的1%淀粉溶液0.5 mL,置于65℃恒溫水浴中,加入超純水0.3 mL,酶液0.2 mL,搖勻,保溫3 min后立即加入3,5-二硝基水楊酸指示劑溶液2.0 mL,搖勻后置于沸水浴5 min,取出進(jìn)行流水冷卻,用超純水定容至10 mL,在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度(O.D.)值,計(jì)算生成麥芽糖質(zhì)量。淀粉酶活力單位定義為:在65℃下,每分鐘催化淀粉生成1 mg麥芽糖作為1個(gè)酶活力單位U(mg/min)。

酶液蛋白濃度測(cè)定:以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±S. E.)表示,并用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)法統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹類(lèi)胰蛋白酶和胃蛋白酶活力的影響

由圖1、2可看出,氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹類(lèi)胰蛋白酶和胃蛋白酶活力影響顯著(P<0.05),而對(duì)照組無(wú)明顯變化。各處理組中腸腺的類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)呈峰值變化,分別于24和12 h時(shí)達(dá)到最小值和最大值,其中類(lèi)胰蛋白酶活力在48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平,而胃蛋白酶活力在24 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān);各處理組胃和腸的類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶活力在48 h內(nèi)也呈明顯的峰值變化,均于12 h時(shí)達(dá)到最大值,2種消化器官中類(lèi)胰蛋白酶活力于48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平,而胃蛋白酶活力分別于48、24 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。

2.2 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹脂肪酶活力的影響

圖3表明,氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹中腸腺和胃的脂肪酶活力的影響顯著(P<0.05),而對(duì)照組無(wú)明顯變化;腸中脂肪酶活力很低,實(shí)驗(yàn)未檢出。各處理組2種消化器官中脂肪酶活力在24 h內(nèi)均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,均于12 h達(dá)到最大值,24 h后中腸腺的脂肪酶活力趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯正相關(guān);而胃的脂肪酶活力逐漸下降,至48 h時(shí)恢復(fù)至對(duì)照組水平。

圖1 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹類(lèi)胰蛋白酶活力的影響Fig.1 Time course changes of Trypsin-like enzyme activities of swimming crabPortunus trituberculatus exposed to ambient ammonia

圖3 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹脂肪酶活力的影響Fig.3 Time course changes of lipase activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

2.3 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹淀粉酶活力的影響

由圖4可知,氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹淀粉酶活力影響顯著(P<0.05),而對(duì)照組無(wú)顯著變化。各處理組中腸腺和腸的淀粉酶活力在12 h內(nèi)呈逐漸下降趨勢(shì),在12 h時(shí)降至最低值,12 h后趨于穩(wěn)定,且與氨氮濃度呈明顯負(fù)相關(guān);各處理組胃的淀粉酶活力呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì),于12 h達(dá)到最大值,在24～48 h內(nèi)酶活力被抑制,且趨于穩(wěn)定,1、5與20 mg·L-1處理組差異顯著。

圖2 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹胃蛋白酶活力的影響Fig.2 Time course changes of pepsin activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

圖4 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹淀粉酶活力的影響Fig.4 Time course changes of amylase activities of swimming crabPortunus trituberculatusexposed to ambient ammonia

2.4 三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化酶的活性分布

由表1可見(jiàn),三疣梭子蟹不同消化器官中消化酶活力不同,3種消化器官中類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶活力大小均為:中腸腺>腸>胃,而中腸腺、胃的脂肪酶活力大小相近;在氨氮脅迫48 h時(shí),對(duì)中腸腺和胃的胃蛋白酶、脂肪酶活力影響顯著,均表現(xiàn)為明顯的誘導(dǎo)作用,而對(duì)3種消化器官中淀粉酶活力均表現(xiàn)為明顯的抑制作用。

表1 在氨氮脅迫48 h時(shí)三疣梭子蟹消化器官中消化酶的活性分布Table 1 Distribution of the digestive enzymes of different digestive organs ofPortunus trituberculatus exposed to ambient ammonia for 48 h(mean±S.E)

3 討論

3.1 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹消化酶活力的影響

據(jù)王維娜等[18]報(bào)道在不同p H(7.6～9.8)水環(huán)境中飼養(yǎng)14 d時(shí),日本沼蝦(Macrobrochium nipponense)中腸腺類(lèi)胰蛋白酶和胃蛋白酶活力隨著p H值升高而升高,均于p H為9.8時(shí)達(dá)到最大值;楊志彪等[19]研究發(fā)現(xiàn)在Cu2+(0.01～5.00 mg·L-1)作用10 d后,中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)中腸腺類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶和淀粉酶活力隨Cu2+濃度升高均有不同程度降低,而脂肪酶活力隨著Cu2+濃度升高而顯著升高。據(jù)Antoine[20]報(bào)道歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)在氨氮(0.53～16.11 mg·L-1)慢性脅迫下飼料轉(zhuǎn)化率隨著氨氮濃度升高而升高。本研究表明三疣梭子蟹在氨氮脅迫下3種消化器官中消化酶活力均呈現(xiàn)明顯的峰值變化,至24和48 h時(shí)趨于穩(wěn)定或恢復(fù)至對(duì)照組水平,穩(wěn)定后各處理組中腸腺胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官淀粉酶活力分別與氨氮濃度呈明顯正、負(fù)相關(guān)性,表現(xiàn)出明顯的時(shí)間、劑量效應(yīng)關(guān)系,這與上述環(huán)境脅迫對(duì)甲殼動(dòng)物消化酶活力影響的研究結(jié)果基本類(lèi)似。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)中1 mg·L-1氨氮處理組(相當(dāng)于非離子氨濃度0.033 mg·L-1)接近《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607-89)非離子氨濃度允許范圍上限0.020 mg·L-1,對(duì)消化酶活力也產(chǎn)生顯著性影響,這說(shuō)明消化酶活力可以靈敏地反映出三疣梭子蟹在氨氮脅迫下消化吸收能力的變化。因此,作者認(rèn)為三疣梭子蟹在氨氮脅迫下中腸腺中胃蛋白酶、脂肪酶活力和3種消化器官中淀粉酶活力可作為消化吸收能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.2 氨氮脅迫對(duì)三疣梭子蟹消化生理的影響機(jī)制

甲殼動(dòng)物因環(huán)境脅迫或刺激產(chǎn)生一系列的生理防御反應(yīng),當(dāng)超出機(jī)體自身特定的生理代謝機(jī)能時(shí),可啟動(dòng)機(jī)體的代謝補(bǔ)償功能以適應(yīng)外界環(huán)境的變化,最終產(chǎn)生應(yīng)激適應(yīng)。本研究顯示在氨氮脅迫范圍內(nèi),除中腸腺類(lèi)胰蛋白酶活力表現(xiàn)為明顯的抑制作用外,三疣梭子蟹3種消化器官中類(lèi)胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶活力在12 h時(shí)均達(dá)到最大值,表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)作用,而且胃、腸中蛋白酶的誘導(dǎo)作用隨脅迫濃度增大而降低,而脂肪酶呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。已有研究表明甲殼動(dòng)物受到氨氮脅迫產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),耗氧量增多,能量需求增加,生理代謝發(fā)生相應(yīng)的變化[4-8];Stebbing[21]認(rèn)為在毒物作用下生物酶出現(xiàn)的這種增益現(xiàn)象,是在無(wú)毒情況下的1種刺激反應(yīng),并把這一現(xiàn)象稱(chēng)為“毒物興奮效應(yīng)”。這說(shuō)明三疣梭子蟹因氨氮脅迫短時(shí)間內(nèi)消化酶活力升高,提高了機(jī)體的消化吸收利用能力,可能是用于補(bǔ)償因環(huán)境應(yīng)激所需的能量消耗,滿(mǎn)足機(jī)體應(yīng)激代謝的能量需求,同時(shí)這種“毒物興奮效應(yīng)”在胃、腸中對(duì)不同消化酶的誘導(dǎo)表現(xiàn)不同,這主要是因?yàn)椤岸疚锱d奮效應(yīng)”不僅與氨氮脅迫濃度有關(guān),而且不同消化酶對(duì)氨氮脅迫的生理適應(yīng)程度也有差異,由此在生理代謝補(bǔ)償適應(yīng)機(jī)制方面有待進(jìn)一步研究。

據(jù)Kleber等[22]報(bào)道圣保羅對(duì)蝦(Farf antepenaeus paulensis)幼蝦在低濃度氨氮(0.016～0.287 mg·L-1)長(zhǎng)期暴露下,能量代謝同樣發(fā)生顯著改變,表現(xiàn)為機(jī)體脂質(zhì)含量顯著減少,碳水化合物含量顯著增多;Hong等[8]研究表明暴露于氨氮(20～80 mg·L-1)48 h時(shí),中華絨螯蟹幼蟹會(huì)通過(guò)減少碳水化合物的代謝,同時(shí)增加脂質(zhì)利用來(lái)滿(mǎn)足機(jī)體代謝需求,這與Racotta等[7]將凡納濱對(duì)蝦(L itopenaeus vannamei)幼蝦置于氨氮(0.36～2.14 mmol/L)暴露24 h時(shí)的代謝反應(yīng)是一致的;Chen等[23]研究發(fā)現(xiàn)在氨氮(0.994～20.728 mg· L-1)脅迫24 h時(shí),斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)血淋巴中總蛋白濃度也會(huì)顯著下降。本實(shí)驗(yàn)表明在氨氮脅迫48 h時(shí),三疣梭子蟹中腸腺胃蛋白酶、脂肪酶活力表現(xiàn)為明顯的誘導(dǎo)作用,而3種消化器官淀粉酶活力呈現(xiàn)顯著的抑制作用,這與上述研究結(jié)果是相符的。另有Chen等[10]研究顯示隨著氨氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)(24 h后),斑節(jié)對(duì)蝦可能會(huì)通過(guò)中腸腺等組織的解毒代謝來(lái)降低氨氮的毒害作用;張克儉[1]研究發(fā)現(xiàn)在不同濃度氨氮(2.44～11.44 mg·L-1)作用7.5 d時(shí),中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)肝胰臟最明顯的變化就是肝管的吸收細(xì)胞部分或全部轉(zhuǎn)變成分泌細(xì)胞,致使肝管壁中的分泌細(xì)胞增多,分泌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多的分泌小泡,而分泌小泡內(nèi)含有多種酶類(lèi),具有分解消化有機(jī)大分子物質(zhì)和部分解毒代謝作用。由此說(shuō)明甲殼動(dòng)物在氨氮脅迫下可以通過(guò)調(diào)節(jié)消化酶和解毒代謝酶的合成與分泌,提高對(duì)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的消化吸收能力,降低對(duì)糖類(lèi)的消化利用,從而滿(mǎn)足機(jī)體的能量代謝和解毒代謝的需求。作者認(rèn)為氨氮脅迫對(duì)甲殼動(dòng)物中腸腺、胃和腸3種消化酶活力產(chǎn)生不同的影響,不僅與甲殼動(dòng)物對(duì)氨氮的解毒代謝有關(guān),也與消化酶的酸堿特性相關(guān),如許多學(xué)者研究表明隨著水環(huán)境中氨氮濃度升高,甲殼動(dòng)物血淋巴及中腸腺中氨氮濃度增加,氨氮排泄減少,從而導(dǎo)致血淋巴或中腸腺等組織中p H出現(xiàn)變化[9-10,24-25],由此引起消化酶活力出現(xiàn)相應(yīng)變化,其影響機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

[1] 張克儉.鋅和氨氮對(duì)對(duì)蝦肝胰臟的毒性作用[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 1993,17(1):52-59.

[2] Rebelo M F,Rodriguez E M,Santos E A.Histopathological changes in gills of the estuarine crabChasmagnathus granulate (Crustacea-Decapoda)following acute exposure to ammonia[J]. Comparative Biochemistry and Physiology,2000,25C:157-164.

[3] Rebelo M F,Santos E A,Monserrat J M.Ammonia exposure of Chasmagnathus granulata(Crustacea,Decapoda)Dana,1851:accumulation in haemolymph and effects on osmoregulation[J]. Comparative Biochemistry and Physiology,1999,122A:429-435. [4] Chen J C,S H Lai.Oxygen consumption and ammonia nitrogen excretion ofPenaeus-japonicusadolescents exposed to ambient ammonia[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1992, 102C(1):129-133.

[5] Chen J C,F H Nan.Effects of ammonia on oxygen consumption and ammonia-nitrogen excretion ofPenaeus chinensisafter prolonged exposure to ammonia[J].Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,1993,51(1):122-129.

[6] Chen J C,Lin C Y.Responses of oxygen consumption,ammonia-N excretion and urea-N excretion ofPenaeus chinensisexposed to ambient ammonia at different salinity and pH levels[J].Aquaculture,1995,136:243-255.

[7] Racotta I S,R Hernandez-Herrera.Metabolic responses of the white shrimp,Penaeus vannamei,to ambient ammonia[J].Comparative Biochemistry and Physiology,2000,125A(4):437-443.

[8] Chen J C,Chen J M.Arginase specific activity and nitrogenous excretion of Penaeus japonicus exposed to elevated ambient ammonia[J].Marine Ecology Progress Series,1997,153:197-202.

[9] Hong M L,Chen L Q,Sun XJ,et al.Metabolic and immune responses in Chinese mitten-handed crab(Eriocheir sinensis)juveniles exposed to elevated ambient ammonia[J].Comparative Biochemistry and Physiology,2007,145C:363-369.

[10] Chen J M,Chen J C.Study on the free amino acid levels in the hemolymph,gill,hepatopancreas and muscle ofPenaeus monodonexposed to elevated ambient ammonia[J].Aquatic Toxicology,2000,50(1-2):27-37.

[11] 洪美玲,陳立橋,顧順樟,等.氨氮脅迫對(duì)中華絨螯蟹免疫指標(biāo)及肝胰腺組織結(jié)構(gòu)的影響[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),2007,14(3): 412-418.

[12] Chen J C,Liu P C,Lin Y T.Super intensive culture of red-tailed shrimpPenaeus penicillatus[J].Journal of World Aquaculture Society,1988,19:127-131.

[13] 鐘碩良,陳月忠,林克冰,等.蝦池底質(zhì)中NH4+-N、S2-和異養(yǎng)細(xì)菌含量的變化及其相關(guān)性研究[J].臺(tái)灣海峽,1997,16(4): 449-454.

[14] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范GB17378.4-2007[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[15] 潘魯青,王克行.中華絨螯蟹幼體消化酶活力與氨基酸組成的研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué),1997,4(2):13-20.

[16] 江慧芳,王雅琴,劉春國(guó).三種脂肪酶活力測(cè)定方法的比較及改進(jìn)[J].化學(xué)與生物工程,2007,24(8):72-75.

[17] Bradfor M M.A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[18] 王維娜,孫儒泳,王安利,等.環(huán)境因子對(duì)日本沼蝦消化酶和堿性磷酸酶的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2002,13(9):1153-1156.

[19] 楊志彪,趙云龍,周忠良,等.水體銅對(duì)中華絨螯蟹體內(nèi)銅分布和消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2005,29(4):496-501.

[20] Antoine D,Jeanine P R,Denis C,et al.Effect of chronic exposure to ammonia on growth,food utilization and metabolism of the European sea bass(Dicentrarchus labrax)[J].Aquatic Living Resources,2003,16:509-520.

[21] Stebbing A R D.Hormes is the stimulation of growth by low levels of inhibitors[J].The Science of The Total Environment, 1982,22(3):213-234.

[22] Kleber Campos Miranda-Filho,Grasiela Lopes Le es Pinho,Wilson Wasielesky Jr.,et al.Long-term ammonia toxicity to the pink-shrimpFarf antepenaeus paulensis[J].Comparative Biochemistry and Physiology,2009,150 C:377-382.

[23] Chen J C,Cheng S Y.Hemolymph PCO2,hemocyanin,protein levels and urea excretions ofPenaeus monodonexposed to ambient ammonia[J].Aquatic Toxicology,1993,27:281-292.

[24] Chen J C,Cheng S Y,Chen C T,et al.Changes of oxyhemocyanin,protein and free amino acid levels in the hemolymph of Penaeus japonicusexposed to ambient ammonia[J].Comparative Biochemistry and Physiology,1994,109A:339-347.

[25] Chen J C,Kou Y Z.Accumulation of ammonia in the haemolymph ofPenaeus monodonexposed to ambient ammonia[J]. Aquaculture,1993,109:177-185.

Abstract: To study the effects of ammonia-N stress on the activities of digestive enzymes in the midgut gland,stomach and intestine ofPortunus trituberculatus,groups in different ammonia-N concentrations (0,1,5 and 20 mg·L-1)were setup in laboratory condition for comparison among the groups.Results showed that ammonia-N stress had significant effects on the activities of trypsin-like enzyme,pepsin,lipase and amylase(P<0.05).The activities of trypsin-like enzyme and pepsin in the three digestive organs showed peak changes within 48 h,and trypsin-like enzyme recovered to the control level at 48 h; while pepsin related to the ammonia concentration positively in the midgut gland became stable from 24 h; pepsin in the stomach and intestine restored to the control level at 48 h and 24 h.The activity of lipase in the midgut gland and stomach also showed peak changes within 24 h,and lipase related to the ammonia concentration positively in the midgut gland became stable;while lipase in the stomach decreased gradually and returned to the control level at 48 h.The activity of amylase in the midgut gland and intestine decreased gradually within 12 h,reached the minimum which was related to the ammonia concentration negatively at 12 h and then kept stable;while amylase in the stomach increased firstly and then decreased. Moreover,ammonia-N stress induced the activities of pepsin and lipase in the midgut gland significantly and had a significant inhibition effect on the activity of amylase in the three digestive organs at 48 h.The present study suggested that the activities of pepsin and lipase in the midgut gland and amylase in the three digestive organs could be used as evaluation indexes for the abilities of digestion and absorption of the crabs during ammonia-N stress.

Key words: ammonia-N stress;Portunus trituberculatus;digestive enzyme activity

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Effects of Ammonia-N Stress on Digestive Enzyme Activities of Swimming Crab Portunus trituberculatus

XU Wu-Jie1,PAN Lu-Qing1,YUE Feng1,LI Jian2
(1.Key Laboratory of Mariculture,Ministry of Education,Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.Yellow Sea fisheries Research Institute,CAFS,Qingdao 266071,China)

S917

A

1672-5174(2011)06-035-06

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(2006AA10A406);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目(NCET-06-0597)資助

2010-07-27;

2010-11-08

徐武杰(1984-),男,博士生,主要從事對(duì)蝦環(huán)境生理學(xué)的研究。E-mail:phy@ouc.edu.cn

E-mail:panlq@ouc.edu.cn