閆秀英,吳灶和,簡(jiǎn)紀(jì)常,魯義善,孫修勤

(1.廣東海洋大學(xué)廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524025; 2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心,山東青島266061)

淋巴囊腫病毒mcp基因變異特征及其基因型分析

閆秀英1,吳灶和1,簡(jiǎn)紀(jì)常1,魯義善1,孫修勤2

(1.廣東海洋大學(xué)廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524025; 2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心,山東青島266061)

淋巴囊腫病毒是引起多種海、淡水魚(yú)淋巴囊腫病的病原,且不同淋巴囊腫病毒分離株間存在一定的差異。本文對(duì)25株淋巴囊腫病毒分離株mcp基因的變異特征進(jìn)行分析,結(jié)果表明:分離自同一宿主的淋巴囊腫病毒mcp基因序列并非完全一致,有些同宿主分離株間存在著較少的變異,其MCP蛋白序列間的變異位點(diǎn)多位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域、屬于非蛋白相互作用位點(diǎn);分屬不同基因型淋巴囊腫病毒分離株MCP蛋白序列間的變異位點(diǎn)也多位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域,變異位點(diǎn)為蛋白相互作用位點(diǎn)的比率僅占21.98%。金頭鯛淋巴囊腫病毒分離株LCDV-sa是一種新的淋巴囊腫病毒基因型,此25株淋巴囊腫病毒可分為7個(gè)基因型。對(duì)淋巴囊腫病毒變異的研究,可加深對(duì)其感染機(jī)制的認(rèn)識(shí),有助于了解其傳播途徑,可為淋巴囊腫病的防控提供重要的理論依據(jù)。

淋巴囊腫病毒;mcp基因;變異;基因型

淋巴囊腫病毒(Lymphocystis disease virus, LCDV)屬于虹彩病科(Iridoviridae)、淋巴囊腫病毒屬(L ym phocystivirus)[1],可引起全球140多種淡、海水魚(yú)發(fā)生淋巴囊腫病[2-3],也可在多種海、淡水魚(yú)細(xì)胞中擴(kuò)增并引起宿主細(xì)胞產(chǎn)生病變現(xiàn)象[4-5]。淋巴囊腫病毒一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

淋巴囊腫病毒是雙鏈DNA病毒,目前已獲得LCDV-1(歐洲株)和LCDV-C(中國(guó)株)全基因組序列[6-7],但二者基因組差異很大,如LCDV-1基因組為102,653 bp,編碼195個(gè)ORF,而LCDV-C基因組為186 250 bp,編碼240個(gè)ORF。比較LCDV-1和LCDV-C基因組發(fā)現(xiàn),mcp基因相似率最高,為78.9%[8]。在淋巴囊腫病毒屬,mcp基因是相當(dāng)保守的,但同時(shí)也存在著足以區(qū)分相近淋巴囊腫病毒分離株的變異。mcp基因的進(jìn)化,適宜作為淋巴囊腫病毒系統(tǒng)關(guān)系分析的分子標(biāo)記[9]。目前的資料表明淋巴囊腫病毒應(yīng)該存在多種基因型,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的有:淋巴囊腫病毒基因型I(包括LCDV-1)、淋巴囊腫病毒基因型II (包括牙鲆分離株等)、淋巴囊腫病毒基因型III(包括巖魚(yú)分離株)[8]、淋巴囊腫病毒基因型IV(包括軍曹魚(yú)和鱸魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型V(包括玻璃魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型VI(包括珍珠魚(yú)分離株)[10-11]。

本文對(duì)25株不同淋巴囊腫病毒分離株mcp基因變異特征及其基因型進(jìn)行分析,從而為了解病毒感染的地緣分布和在不同宿主群體中的差異奠定基礎(chǔ),同時(shí),也為了解病毒在感染過(guò)程中與環(huán)境因子間的作用特征和進(jìn)化趨勢(shì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本文所用的25株淋巴囊腫病毒分離株和石斑魚(yú)虹彩病毒GIVmcp基因序列取自GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。表1為各淋巴囊腫病毒分離株[5-6,8,10,11-13]和石斑魚(yú)虹彩病毒的名稱、縮略名、采集地、宿主和mcp基因序列的GenBank編號(hào)。

1.2 方法

1.2.1 mcp基因序列分析 通過(guò)DNAStar軟件并結(jié)合人工調(diào)整,對(duì)mcp基因DNA序列進(jìn)行排序;用MEGA5.0[14]和DnaSP[15]軟件分析變異位點(diǎn)、信息位點(diǎn)和遺傳距離。

1.2.2 淋巴囊腫病毒系統(tǒng)關(guān)系分析 利用Mode1 T est[16]對(duì)淋巴囊腫病毒的mcp序列做進(jìn)化模式模擬,并將不同的模擬結(jié)果作為參考值構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。用MEGA5.0[14]軟件,構(gòu)建最大簡(jiǎn)約樹(shù)(ME)、最大似然樹(shù)(ML)、鄰接樹(shù)(NJ)和UPGMA樹(shù)。用MrBayes軟件進(jìn)行Bayesian分析,并采用genera1 time reversible +gamma+invariants(GTR+G+I)序列進(jìn)化模型和Markov Chain Monte Carlo(McMc)取樣方式估計(jì)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。MrBayes分析參數(shù)為:nst=6,rates=gamma,進(jìn)行10 000 000次重復(fù)檢驗(yàn)后,統(tǒng)計(jì)所得結(jié)果,獲得系統(tǒng)樹(shù)的支系結(jié)構(gòu)和各支的置信度。后驗(yàn)概率和系統(tǒng)樹(shù)枝長(zhǎng)計(jì)算參數(shù)為:bumin=500,contype= allcompat。

表1 淋巴囊腫病毒分離株的名稱、縮略名、采集地、宿主和mcp基因序列的GenBank編號(hào)Table 1 The abbreviations of LCDV isolates,collected locations,hosts and accession numbers ofmcpgene sequences in GenBank

用PAUP[17]軟件進(jìn)行運(yùn)算,Heuristic搜索采用二分支方式構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)支系(TBR branch swapping),并加入隨機(jī)序列重復(fù)抽樣;系統(tǒng)樹(shù)各支的置信度,通過(guò)Bootstrap[18]重復(fù)抽樣1000次后獲得。

1.2.3 MCP蛋白序列分析 通過(guò)DNAstar軟件并結(jié)合人工調(diào)整,對(duì)MCP蛋白序列進(jìn)行排序;用Blast軟件分析其變異位點(diǎn)。

1.2.4 MCP蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用Jpred、Net-SurfP、DLP-SVM、Porter、PSIpred、PredictProtein軟件對(duì)MCP蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.5 MCP三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) SWISS-3DIMAGE軟件進(jìn)行MCP蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬。用Smart軟件對(duì)MCP蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果

2.1 mcp基因序列分析

所分析的25株淋巴囊腫病毒分離株mcp基因部分序列長(zhǎng)度為1323 bp,含有352個(gè)信息位點(diǎn)、457個(gè)變異位點(diǎn),其中,位于第3位密碼子的變異位點(diǎn)有320個(gè)、比率為70%;位于第2位密碼子的變異位點(diǎn)有47個(gè);位于第1位密碼子的變異位點(diǎn)有90個(gè)。

表2 淋巴囊腫病毒分離株兩兩間的mcp基因序列相似度(對(duì)角線之上)和遺傳距離(對(duì)角線之下)[×1000]Table 2 The identity rate ofmcpgene sequemce(upper diagonal)and the divergence(lower diagonal)among LCDV isolation[×1000]

從中國(guó)牙鲆分離的LCC1、LCN1與從韓國(guó)牙鲆分離的LJ F1、LJ F2、LJ F3、LJ F5、LJ F8、LJ F9mcp基因序列完全相同;從韓國(guó)牙鲆分離到的LJ F0、LJ F4的mcp基因序列存在3個(gè)變異位點(diǎn);從日本牙鲆分離到的LJ F6、LJ F7的mcp基因序列存在4個(gè)變異位點(diǎn);從中國(guó)、韓國(guó)和日本牙鲆分離到的LCN1、LJ F0、LJ F4、LJ F6、LJ F7的mcp基因序列間存在9個(gè)變異位點(diǎn)。

從韓國(guó)巖魚(yú)分離到的LRF1、LRF2、LRF3的mcp基因序列完全相同,而從該魚(yú)分離到的LRF1、LRF4、LRF5的mcp基因序列間存在12個(gè)變異位點(diǎn)。

從中國(guó)軍曹魚(yú)分離到的LRC1、LRC2的mcp基因序列完全相同,但從該魚(yú)分離到的LRC1、LRC3的mcp基因序列間存在4個(gè)變異位點(diǎn)。

2.2 淋巴囊腫病毒系統(tǒng)關(guān)系分析結(jié)果

基于mcp基因序列,應(yīng)用多種軟件所構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)是一致的,置信度也基本相同。圖1為基于mcp基因序列構(gòu)建的UPGMA樹(shù),可見(jiàn)此系統(tǒng)樹(shù)包括7個(gè)分支:LCDV-1為一分支,位于系統(tǒng)樹(shù)的基部,與其它淋巴囊腫病毒分離株的系統(tǒng)關(guān)系較遠(yuǎn);巖魚(yú)淋巴囊腫病毒分離株和珍珠魚(yú)淋巴囊腫病毒分離株各獨(dú)為一支,且二者聚為一大支,表明二者親緣關(guān)系較近;金頭鯛淋巴囊腫病毒分離株和玻璃拉拉魚(yú)淋巴囊腫病毒分離株各獨(dú)為一支,且二者也聚為一大支,表明二者親緣關(guān)系較近;軍曹魚(yú)淋巴囊腫病毒分離株和鱸魚(yú)淋巴囊腫病毒分離株為一支,且二者小分支間的距離很小,說(shuō)明二者親緣關(guān)系很近;牙鲆淋巴囊腫病毒分離株為一支,位于系統(tǒng)樹(shù)的頂部,且它們的親緣關(guān)系非常近。

圖1 基于mcp基因序列構(gòu)建的UPGMA樹(shù)(數(shù)字為置信度)Fig.1 The UPGMA tree of LCDV isolations based onmcpgene sequence(The number shows the degree of belief)

2.3 MCP蛋白序列分析結(jié)果

所分析存在差異的15株淋巴囊腫病毒MCP蛋白部分序列長(zhǎng)度為441 aa,共有91個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生變異。

15株淋巴囊腫病毒分離株MCP蛋白序列變異位點(diǎn)見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)從韓國(guó)牙鲆分離到的LJ F0、LJ F4的 MCP蛋白序列存在2個(gè)變異位點(diǎn),從日本牙鲆分離到的LJ F6、LJ F7的MCP蛋白序列存在3個(gè)變異位點(diǎn),從中國(guó)、韓國(guó)、日本牙鲆分離到的LCN1、LJ F0、LJ F4、LJ F6、LJ F7的MCP蛋白序列間存在6個(gè)變異位點(diǎn)。從韓國(guó)巖魚(yú)分離到的LRF1、LRF4、LRF5的mcp基因序列間存在8個(gè)變異位點(diǎn)。從中國(guó)軍曹魚(yú)分離到的LRC1、LRC3的MCP蛋白序列間存在2個(gè)變異位點(diǎn)。

圖2 淋巴囊腫病毒MCP蛋白序列變異位點(diǎn)(灰色為變異位點(diǎn))Fig.2 Sequence alignment of MCP of LCDV(the yellow denote the variable sites)

2.4 MCP二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

應(yīng)用Jpred、NetSurfP、DLP-SVM、Porter、PSIpred、PredictProtein軟件對(duì)MCP蛋白序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致,圖3顯示了MCP蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白相互作用位點(diǎn)。

圖3 淋巴囊腫病毒MCP蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)和蛋白相互作用位點(diǎn)預(yù)測(cè)(灰色為變異位點(diǎn))Fig.3 Predicted secondary structure and protein-protein interaction sites of MCP of LCDV(the yellow denote the variable sites)注:H=α-helix;E=β-strand;C=random coil;P=protein-protein interaction sites

2.5 MCP三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

應(yīng)用SWISS-3DIMAGE軟件對(duì)MCP蛋白三維結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 MCP蛋白三維模擬結(jié)構(gòu)Fig.4 The three dimensional model structure of MCP

圖5 MCP功能結(jié)構(gòu)域Fig.5 Motifs of MCP

圖5 為MCP蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)結(jié)果,可見(jiàn)MCP蛋白序列中的236-456 aa片段是Capsid功能結(jié)構(gòu)域。

3 討論

自然界中任何物種都存在變異,而為了適應(yīng)在不同宿主細(xì)胞中的增殖,病毒可能會(huì)發(fā)生更多的基因變異。變異是生物體進(jìn)化的根本原因,是生物進(jìn)化的規(guī)律。病毒進(jìn)化一般具有2條途徑,一是病毒與宿主共同進(jìn)化,一是病毒選擇多種宿主,從而具有更為廣闊的生存環(huán)境。一般而言,DNA病毒進(jìn)化依照第一條途徑[19]。

病毒的變異和進(jìn)化,是病毒與宿主細(xì)胞和病毒與宿主個(gè)體及群體相互作用的結(jié)果。病毒的進(jìn)化使病毒結(jié)構(gòu)和特性不斷發(fā)生適應(yīng)性變化,甚至還有一些新種的出現(xiàn)。在病毒和細(xì)胞相互作用的過(guò)程中,由于宿主本身的原因,使病毒發(fā)生突變的概率是很大的。對(duì)病毒標(biāo)準(zhǔn)種的基因序列多樣性進(jìn)行分析研究,可了解病毒感染空間的地緣分布和對(duì)不同宿主群體的差異[20]。

迄今為止,已在歐、亞、美洲等地分離到多株淋巴囊腫病毒,有報(bào)道說(shuō)不同宿主的淋巴囊腫病毒存在著變異[6-7,10,21]。本研究發(fā)現(xiàn),有些分離自同一種宿主魚(yú)、不同或相同地域的淋巴囊腫病毒分離株,其mcp基因序列是一致的,如韓國(guó)巖魚(yú)分離株LRF1、LRF2、LRF3,中國(guó)軍曹魚(yú)分離株LRC1和LRC2,中國(guó)牙鲆分離株LCC1、LCN1和韓國(guó)牙鲆分離株LJ F1、LJ F2、LJ F3、LJ F5、LJ F8、LJ F9。其中韓國(guó)和中國(guó)地理位置較近,在兩國(guó)分離到的牙鲆淋巴囊腫病毒可認(rèn)為來(lái)自同一地域。但有些分離自同一種宿主魚(yú)、同一地域的淋巴囊腫病毒分離株,其mcp基因序列也存在著變異,如LRF1、LRF4、LRF5的mcp基因序列間存在12個(gè)變異位點(diǎn),LRC1、LRC3的mcp基因序列間存在4個(gè)變異位點(diǎn),LJ F0、LJ F4的mcp基因序列間存在3個(gè)變異位點(diǎn),LJ F6、LJ F7的mcp基因序列間存在4個(gè)變異位點(diǎn)。分離自同一宿主——牙鲆、不同地域(中國(guó)、韓國(guó)、日本)的淋巴囊腫病毒分離株LCN1、LJ F0、LJ F4、LJ F6、LJ F7的mcp基因序列間存在9個(gè)變異位點(diǎn)。這說(shuō)明分離自同一宿主魚(yú)的淋巴囊腫病毒變異較少,與地域的關(guān)系不大。

LJ F0、LJ F4 MCP蛋白序列間存在的2個(gè)變異位點(diǎn)中,1個(gè)位于β折疊區(qū),1個(gè)位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域,非P位點(diǎn);LJ F6、LJ F7 MCP蛋白序列間存在的3個(gè)變異位點(diǎn)都位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)區(qū),非蛋白相互作用位點(diǎn);LCN1、LJ F0、LJ F4、LJ F6、LJ F7 MCP蛋白序列間存在的6個(gè)變異位點(diǎn)中,有4個(gè)位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域,2個(gè)位于折疊區(qū),非蛋白相互作用位點(diǎn);LRF1、LRF4、LRF5 MCP基因序列間存在的8個(gè)變異位點(diǎn)中,有2個(gè)位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域,4個(gè)位于折疊區(qū),2個(gè)位于螺旋區(qū),非蛋白相互作用位點(diǎn);LRC1、LRC3 MCP蛋白序列間存在2個(gè)變異位點(diǎn)都位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域,非蛋白相互作用位點(diǎn)?？梢?jiàn),來(lái)自同一宿主的淋巴囊腫病毒MCP蛋白序列存在更少的變異,變異位點(diǎn)多位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域(57.14%),其次是折疊區(qū)(33.33%),再次是螺旋區(qū)(9.52%),而且變異位點(diǎn)全為非蛋白相互作用位點(diǎn)。

病毒的基因型分型目前還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行核苷酸序列分析是病毒基因型分型的方法之一。Okamoto[22]首先進(jìn)行HBV核苷酸全序列分析,提出核苷酸序列差異度≥8%或同源性≤92%為分型界限。而且在淋巴囊腫病毒中,mcp基因是全基因組中相當(dāng)保守的基因[9],是分析LCDV基因型的合適分子標(biāo)記。由LCDV各分離株間的遺傳距離(見(jiàn)表2)和構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)(見(jiàn)圖1)分析可得,此25株淋巴囊腫病毒可分為7個(gè)基因型,即淋巴囊腫病毒基因型I(LCDV-1)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅱ(牙鲆分離株)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅲ(巖魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅳ(軍曹魚(yú)和鱸魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅴ(玻璃拉拉魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅵ(珍珠魚(yú)分離株)、淋巴囊腫病毒基因型Ⅶ(金頭鯛分離株),其中金頭鯛淋巴囊腫病毒分離株LCDV-sa是1種新的基因型——淋巴囊腫病毒基因型Ⅶ。本研究的結(jié)論與閆秀英[10]和Hossain[11]的相關(guān)研究結(jié)論相符,不支持Kitamura[21]和Kvitt[23]的相關(guān)結(jié)論3個(gè)基因型的認(rèn)定。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),淋巴囊腫病毒基因型和其宿主存在很大的關(guān)系,體現(xiàn)了淋巴囊腫病毒與宿主共進(jìn)化的進(jìn)化途徑。

淋巴囊腫病毒mcp基因變異的主要原因是基因突變,由圖2和圖3比較可知,同宿主淋巴囊腫病毒分離株變異位點(diǎn)是一致的,不同基因型淋巴囊腫病毒分離株MCP蛋白序列間的多數(shù)變異位點(diǎn)位于不規(guī)則結(jié)構(gòu)域(62.6%);變異位點(diǎn)為蛋白相互作用位點(diǎn)的比率僅為21.98%,大部分變異位點(diǎn)為非蛋白相互作用位點(diǎn)。由圖3和圖5可見(jiàn),在MCP蛋白序列中,前90 aa(未知功能結(jié)構(gòu)區(qū))變異很少,且不是蛋白相互作用位點(diǎn),推測(cè)淋巴囊腫病毒mcp基因的進(jìn)化可能并未改變MCP蛋白的基本結(jié)構(gòu)和基本功能。

淋巴囊腫病毒變異的深入研究,可加深其感染機(jī)制的認(rèn)識(shí),這對(duì)淋巴囊腫病的防治將產(chǎn)生重要影響。隨著不同淋巴囊腫病毒分離株基因組全序列的測(cè)定,將能更清楚地闡明淋巴囊腫病毒的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為了解其傳播途徑和淋巴囊腫病防控提供重要的理論依據(jù)。

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Abstract: Lymphocystis disease virus(LCDV)can cause lymphocystis disease in more than 140 fish species in seawater and freshwater,and there is some variations among different strains.We analyzed the mcpgene sequence in 25 LCDV isolations,results showed not all of themcpgene sequence in LCDV isolated from the same host is consistent.There are a few variant sites between different nucleotide acids among themcpgene sequences of some LCDV isolated from the same host,these sites usually locate on the random coil,only 21.98%are on the oprotein-protein interaction sites according to the software prediction.LCDV isolated fromsparus auratais attributed a new lymphocystis diseae virus genotype.The 25 LCDV isolations are respectively attributed seven genotypes.The research on variation of lymphocystis diseae virus can help to know more the spreading way.These can provide important academic basis for preventing and controlling lymphocystis disease.

Key words: lymphocystis disease virus;mcpgene;variation;genotype

責(zé)任編輯 于 衛(wèi)

Sequence Variation in mcp Gene of Lymphocystis Disease Virus and the Genotype Analysis

YAN Xiu-Ying1,WU Zao-He1,J IAN Ji-Chang1,LU Yi-Shan1,SUN Xiu-Qin2
(1.Guangdong Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Guangdong Ocean U-niversity,Zhanjiang 524025,China;2.First Institute of Oceanography SOA,Qingdao 266061,China)

Q319;Q931

A

1672-5174(2011)04-039-07

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD29B05);廣東省科技計(jì)劃重大專項(xiàng)(2008A020100014)資助

2010-07-28;

2010-11-21

閆秀英(1978-),女,講師。E-mail:yanxiuying1201@126.com