朱華旭， 黃 山， 陸文聰， 紐 冰， 郭立瑋*

(1．南京中醫(yī)藥大學中藥復方分離工程重點實驗室，江蘇 南京210029;2．青島科技大學化工學院，山東 青島266042;3．上海大學理學院，上海210029)

黃連解毒湯為唐·王燾所著《外臺秘要》中收藏的一首名方，由四味大苦大寒、瀉火解毒藥——黃連、黃柏、黃芩和梔子組成，方中以黃連為君，瀉心火、兼瀉中焦之火;黃芩為臣，瀉上焦之火;黃柏為佐，瀉下焦之火;梔子為使，通瀉三焦之火、導以下行。四藥合用，其瀉火解毒之效甚著，故適用于表里三焦火熱亢盛之證［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃連解毒湯及其有效部位具有明顯的抗氧化、改善腦缺血和益智作用［2-3］。

近年來，國內(nèi)外學者對黃連解毒湯化學成分的配伍變化進行了深入的研究，由于全方酸性與堿性成分共存，湯劑在水煎煮過程中產(chǎn)生大量沉淀，從而造成后續(xù)精制分離工藝取舍較難。在前期的研究中，闡明了配伍提取時各指標性成分轉(zhuǎn)移率的變化［4］，并建立了全方水煎煮動態(tài)提取過程中，方中指標性成分——總生物堿、總黃酮、小檗堿、藥根堿、巴馬亭、黃芩苷和梔子苷隨時間變化的擬合方程［5］。

為了進一步闡明成分組合的變化可能導致的藥效變化［6］，為該藥的臨床應(yīng)用與新劑型開發(fā)提供實驗依據(jù)，本實驗選用藥效學實驗結(jié)果評價可用于工業(yè)化生產(chǎn)的膜分離和大孔吸附樹脂技術(shù)對黃連解毒湯進行分離精制的有效性，采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)，研究黃連解毒湯3種指標性成分——小檗堿、黃芩苷、梔子苷的配比濃度與藥效作用的相關(guān)性，探討從黃連解毒湯“多元化學組成”與“多靶點作用機理”所表達的極其豐富的生物醫(yī)學信息中尋找蘊藏其中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的方法［7］。

1 儀器、試劑和試藥

Agilent1100高效液相色譜(Agilent 1100四元泵;VWD檢測器;Agilent1100 LC色譜工作站);Nuair US Autoflow CO2Water-jacketed incubator;YJ超凈工作臺(蘇州市潔凈技術(shù)研究所);XSZ-DZ倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠);Spectramax 190酶標儀(美國AD公司);96孔培養(yǎng)板購自COSTA公司;1萬分子量PS膜(廈門膜天膜科技有限公司);BT300-1F型蠕動泵(保定蘭格恒流泵有限公司);AB-8型大孔吸附樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司)。對照品(供定量測定用)購自中國藥品生物制品檢定所，鹽酸小檗堿、黃芩苷、梔子苷批號分別為110713-200208、110715-200212、110749-200511。

鼠性腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤PC-12細胞細胞株由南京中醫(yī)藥大學陸茵教授惠贈。DMSO(34869)、MTT(M2128)購自Sigma公司;培養(yǎng)瓶(CORNING)、濾器(0．22μm)購自 MILLIPORE公司;氯化鉀、過氧化氫、連二亞硫酸鈉購自國藥集團化學試劑有限公司;PBS實驗室自制。

2 實驗方法

2．1 黃連解毒湯全方水提液的制備 藥材黃連(產(chǎn)地四川)、黃柏(產(chǎn)地東北)、黃芩(產(chǎn)地甘肅)、梔子(產(chǎn)地江西)均購自安徽亳州藥材公司，批號為090617。稱取藥材(黃連-黃芩-黃柏-梔子3∶2∶2∶3)0．6 kg，水煎煮2次，第一次10倍量水、第二次8倍量水，每次1．5 h;合并2次煎液，濃縮，得全方水提液(0．2 g 生藥/mL 的水提液)［7］。

2．2 黃連解毒湯各分離部位的制備 根據(jù)數(shù)學組合原理，黃連(君藥，A)、黃芩(臣藥，B)、黃柏(佐藥，C)、梔子(使藥，D)4 味藥組成 11 個組合［4］，分別為:全方組合(ABCD)、君臣藥組合(AB)、君佐藥組合(AC)、君使藥組合(AD)、君臣佐藥組合(ABC)、君臣使藥組合(ABD)、君佐使藥組合(ACD)、臣佐藥組合(BC)、臣使藥組合(BD)、臣佐使藥組合(BCD)、佐使藥組合(CD)，藥材按原方比例取樣1 000 g，以上述的水煎煮工藝提取，合并2次水提液并調(diào)整至0．25 g生藥/mL，再采用膜分離技術(shù)(1萬分子量PS膜超濾液，工藝流程Ⅰ);樹脂吸附技術(shù)(以70%乙醇等洗脫，工藝流程Ⅱ);每組實驗分別標示為組合+工藝流程，共得到22個分離部位。

2．3 藥效學實驗 取各部位樣品，加1%DMSODPBS溶液配制成0．1 g生藥/mL，得 a組;依次稀釋，得1．0×10－2g生藥/mL(b組)，1．0 ×10－3g生藥/mL(c組)，1．0 ×10－4g生藥/mL(d 組)，1．0 ×10－5g生藥/mL(e組)，1．0 ×10－6g生藥/mL(f組)。將平均每孔3×104個PC12細胞種于96孔板中，以180μL(高糖 DMEM ∶小牛血清9∶1、雙抗100單位/mL)的培養(yǎng)基在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，用DPBS液洗滌2次，再以160 μL(低糖DMEM、雙抗100單位/mL)為培養(yǎng)基，對過氧化氫(H2O2)、氯化鉀(KCl)、連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)誘導細胞缺糖缺氧損傷，依次加入各藥物濃度各20μL，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，以570和620 nm為檢測波長，測定吸光度，MTT法檢測細胞活力［8］。計算出各組吸光度值的平均值(A)、SD值、保護率(B)，計算公式如下:

2．4 全方及各分離部位指標性成分檢測 采用HPLC色譜法檢測各指標性成分。色譜條件:色譜柱 Lichrospher C18柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)(江蘇漢邦公司)，檢測波長238 nm(生物堿)、265 nm(梔子苷)、280 nm(黃芩苷);流動相為梯度洗脫，A相為乙腈，B相為0．5%三乙胺(磷酸調(diào)pH3．1)，梯度為0～20 min 5%A～15%A，20～40 min 15%A～20%A，40～50min 20%A～30%A，50～55min 30%A ～5%A［4］。樣品制備方法為超聲提?。?］。

以峰面積為縱坐標(Y)，對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(X)，繪制標準曲線。鹽酸小檗堿標準曲線為 Y=4 ×107X+79 521，R=0．999 9，在0．006 44～0．413 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系;黃芩苷標準曲線為 Y=3 ×107X+180 481，R=0．999 8，在0．013 0 ～0．835 mg/mL 之間呈良好的線性關(guān)系;梔子苷標準曲線為 Y=1 ×107X+37 266，R=0．999 9，在0．011 4～0．730 mg/mL之間呈良好的線性關(guān)系。

3 數(shù)據(jù)挖掘

3．1 數(shù)據(jù)挖掘的目標 研究不同分離方法所得黃連解毒湯分離部位中小檗堿量(以鹽酸小檗堿計)、黃芩苷量、梔子苷量與細胞保護率之間的相關(guān)性，嘗試尋找黃連解毒湯中指標性成分的最優(yōu)濃度配比。

3種指標性成分量與不同細胞模型所得保護率的實驗結(jié)果，見表1。

表1 黃連解毒湯全方及各分離部位指標性成分量與保護率結(jié)果

3．2 實驗結(jié)果 以小檗堿、黃芩苷、梔子苷的濃度為目標變量，通過數(shù)學建模考察3種指標性成分濃度與3種細胞模型保護率之間各自的定性和定量關(guān)系。經(jīng)計算后，初步判斷實驗數(shù)據(jù)為非線性，故選用支持向量機(非線性方法)對數(shù)據(jù)進行分析［9-11］。在WINDOWS環(huán)境下，采用MASTER軟件計算得到3個非線性方程;方程雖然無法直觀地顯示各個變量與目標參數(shù)之間的關(guān)系，但通過對變量和保護率進行敏感性分析，得到指標性成分濃度與保護率之間的對應(yīng)關(guān)系。

3．2．1 3種成分與過氧化氫致?lián)p傷保護率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護率，X為設(shè)定指標性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對變量和保護率進行敏感性分析結(jié)果如下:當小檗堿-黃芩苷-梔子苷的濃度比為1∶13∶12時，對過氧化氫致致細胞損傷的保護率最高。

3．2．2 3種成分與氯化鉀致?lián)p傷保護率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護率，X為設(shè)定指標性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對變量和保護率進行敏感性分析未能得出對于氯化鉀致細胞損傷的保護率的最優(yōu)濃度。

3．2．3 3種成分與連二亞硫酸鈉致?lián)p傷保護率相關(guān)性考察 相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)處理后，其方程如下:

其中y為保護率，X為設(shè)定指標性成分的濃度，Xi為在不用分離方法下得到的指標性成分的濃度，βi為函數(shù)比例系數(shù)(計算參數(shù) c=300，ξ=0．05，δ =1)。

對變量和保護率進行敏感性分析結(jié)果如下:小檗堿-黃芩苷-梔子苷的濃度比為13∶1∶3時，對連二亞硫酸鈉造模的保護率最高。

4 討論

3種損傷細胞模型實驗結(jié)果表明，AC+Ⅰ、AC+Ⅱ、ABC+Ⅰ、ABC+Ⅱ、ACD+Ⅱ、ABD+Ⅰ、BCD+Ⅰ、ABCD+Ⅰ、ABCD+Ⅱ及全方對3種損傷模型均有保護作用，表明膜分離技術(shù)和大孔吸附樹脂技術(shù)可以有效地精制黃連解毒湯復方［12］。

采用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對實驗數(shù)據(jù)進行處理，初步得到了3種成分對過氧化氫造模、對連亞硫酸鈉造模保護率的最佳濃度分別為小檗堿-黃芩苷-梔子苷為1∶13∶12與13∶1∶3;而對于氯化鉀造成的損傷，未能得出最優(yōu)濃度。對于指標性成分的最優(yōu)配伍濃度，還需要進行整體動物實驗的驗證。

支持向量機的數(shù)據(jù)挖掘方法可以作為黃連解毒湯有效部位物質(zhì)基礎(chǔ)研究的數(shù)據(jù)處理手段。

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