黎耀東， 賈 蕓， 盧 軍

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆烏魯木齊830000)

益母草為唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt．的新鮮或干燥地上部分。功效主治:活血調(diào)經(jīng)，利水消腫，清熱解毒;治療水腫、小便不利，可單用，也可配白茅根、澤蘭等使用;治療水瘀互結(jié)，淤血障礙膀胱;可治療瘡癰腫毒，皮膚癮疹;活血調(diào)經(jīng)，用于血滯經(jīng)閉、痛經(jīng)、經(jīng)行不暢，產(chǎn)后惡露不盡、瘀滯腹痛等。益母草也廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代婦科中成藥制劑中，其婦科臨床療效毋庸置疑。現(xiàn)代藥理研究表明，益母草中主要有效成分為益母草堿、水蘇堿等多種生物堿，具有增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫作用;抗血栓形成的作用;對(duì)子宮有興奮作用;抗血小板聚集的作用;益母草制劑對(duì)心肌超微結(jié)構(gòu)，特別是線粒體有保護(hù)作用，明顯地降低血液黏度。

據(jù)統(tǒng)計(jì)［1］，益母草屬植物全球分布，約20種，我國(guó)有12種和2個(gè)變種，廣泛分布于全國(guó)各地，主要生于山野荒地、田埂、河灘、草地、路旁、溪邊等處，部分地區(qū)有栽培。其中益母草 Leonurus japonicus Houtt．為藥用的主要植物，同時(shí)涉及藥用的還有細(xì)葉益 母 草 L．sibiricus Linu．Var．β．grandiflora Benth．，L．manshuricus Yabe、白花益母草 L．sibiricus Linu．Var．a(chǎn)lbiflorus Migo［2］。全國(guó)各地一般自產(chǎn)自銷，藥材質(zhì)量難以控制，產(chǎn)量難以得到保證［3］。本實(shí)驗(yàn)以總生物堿、鹽酸水蘇堿為考察指標(biāo)，對(duì)影響益母草質(zhì)量的品種、產(chǎn)地、采收期、部位等因素進(jìn)行研究。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器和試藥

HPWaters2996高效液相色譜儀，SK25LHC型醫(yī)用數(shù)控超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司);紫外分光計(jì)Sintra20(日本);梅特勒-托利多萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒托力多儀器上海有限公司);HHS-4S電子數(shù)控式恒溫水浴鍋(上?？德穬x器設(shè)備有限公司)。

鹽酸水蘇堿對(duì)照品(批號(hào):712-200907，中國(guó)藥品生物制品檢定所);益母草均采自產(chǎn)地，品種由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥鑒定室李永和(主任中藥師)鑒定。

1．2 總生物堿測(cè)定方法

1．2．1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 配制一定質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，在200～760 nm進(jìn)行掃描，可見(jiàn)光區(qū)于521 nm處有最大吸收。故選擇520 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1．2．2 線性試驗(yàn) 精密量取鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為 1．0272 mg/mL)2．5、5、7．5、10、12．5，分別置25 mL 量瓶中，加 10 mL 0．1 mol/L 鹽酸溶液，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，作為鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液;另取0．1 mol/L鹽酸溶液20 mL，置另一25 mL量瓶中，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，作為空白溶液;置冰水浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，以0．1 mol/L鹽酸溶液為空白，照紫外-分光光度法(附錄ⅤA)，在520 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸收度，用空白試劑的吸收度分別減去對(duì)照品的吸收度，以吸收度的差值為縱坐標(biāo)、濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿在0．102 7～0．513 6 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為:Y=0．426 4X －0．001 0(R=0．999 6，n=5)。

1．2．3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加水50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率50 KHz)，加水補(bǔ)足質(zhì)量，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2后，再使其通過(guò)001×7(732)強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱(內(nèi)徑2 cm，柱高15 cm)，用水洗脫至流出液呈中性，棄洗脫液，再用質(zhì)量濃度2 mol/L氨溶液150 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)脻舛?．1 mol/L的鹽酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，精密加入新制的2%硫氰酸鉻銨溶液3 mL，用0．1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，置冰水浴中放置1 h，用干燥濾紙濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1．3 鹽酸水蘇堿測(cè)定［4-12］

1．3．1 色譜條件 Phenomenex Luna scx色譜柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:0．05 mol/L 磷酸二氫鉀(含0．03%三乙胺和0．1%磷酸，pH 3);體積流量:1 mL/min，柱溫:30℃，波長(zhǎng):192 nm，進(jìn)樣量10μL。鹽酸水蘇堿在上述色譜條件下與其他成分實(shí)現(xiàn)了基線分離，見(jiàn)圖1、2。

圖1 鹽酸水蘇堿HPLC圖

圖2 益母草HPLC圖

1．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱定，加0．1 mol/L鹽酸溶液制成1mg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液2、4、6、8、10、12μL進(jìn)行色譜測(cè)定，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(Y，μg)對(duì)峰面積(X，mAu*sec)進(jìn)行線性回歸，回歸方程為:Y=282．72X+214，r=0．999 8。

1．3．3 供試品溶液的制備 取本品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，精密加水50 mL，稱質(zhì)量，超聲處理(功率 250 W，頻率 50 KHz)30 min，加水補(bǔ)足質(zhì)量，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液20 mL，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，通過(guò)D101 大孔樹(shù)脂(內(nèi)徑 1．5 cm，柱高 10 cm)，以 0．1 mol/L鹽酸溶液150 mL洗脫，合并洗脫液;將上述洗脫液通過(guò)001×7(732)強(qiáng)酸性苯乙烯系陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(內(nèi)徑1．5 cm，柱高15 cm)，水洗至流出液呈中性，棄去水洗脫液;再用2 mol/L氨溶液150 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?．1 mol/L鹽酸溶液溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加0．1 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。精密吸取10μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，即得。

1．4 部分產(chǎn)地益母草生物堿的比較

為了確定野生益母草中生物堿的量是否受產(chǎn)地影響，本研究實(shí)地收集了新疆部分縣市的野生益母草品種;同時(shí)，對(duì)我國(guó)主要藥材市場(chǎng)市售的益母草樣品進(jìn)行采集分析，包括河北安國(guó)藥材市場(chǎng)、廣西玉林藥材市場(chǎng)、安徽亳州藥材市場(chǎng)、廣州清平藥材市場(chǎng)、浙江磐安藥材市場(chǎng)、黑龍江雞西藥材市場(chǎng)。

以上益母草樣品多為新鮮植物，切段，30℃烘至含水量10%左右，按照試驗(yàn)1．2及1．3項(xiàng)中總生物堿測(cè)定方法及鹽酸水蘇堿測(cè)定方法，對(duì)各產(chǎn)地益母草樣品進(jìn)行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

1．5 不同品種益母草生物堿的比較

為了考察不同品種對(duì)生物堿的影響，本研究在同一時(shí)期采集益母草及其常見(jiàn)習(xí)用品種細(xì)葉益母草、白花益母草，并進(jìn)行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同產(chǎn)地、不同品種益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表1 不同產(chǎn)地、不同品種益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產(chǎn)地 品種 采收期 總生物堿/% 水蘇堿/%新疆布爾津縣益母草 花初期(6月中)2．42 ±0．07 1．58 ±0．06新疆哈巴河縣白花益母草 花初期(6 月中)1．63 ±0．04 0．91 ±0．02新疆伊寧縣 益母草 花初期(6月中)0．88±0．09 0．34±0．04新疆霍城縣 白花益母草 花初期(6月中)1．47±0．03 0．79±0．03新疆福?？h 益母草 花初期(6月中)1．11±0．05 0．56±0．02新疆富蘊(yùn)縣 細(xì)葉益母草 花初期(6月中)1．26±0．09 0．62±0．03新疆青河縣 細(xì)葉益母草 花初期(6月中)1．39±0．07 0．68±0．02廣州清平 益母草 花初期(干品) 0．95±0．03 0．49±0．02廣西玉林 益母草 花初期(干品) 0．71±0．02 0．33±0．01安徽亳州 益母草 花初期(干品) 1．51±0．02 0．64±0．02河北安國(guó) 益母草 花初期(干品) 1．77±0．04 0．81±0．03浙江磐安 益母草 花初期(干品) 1．42±0．02 0．63±0．03黑龍江雞西 益母草 花初期(干品)1．66 ±0．04 0．74 ±0．03

1．6 不同采收期益母草生物堿的比較

為了考察不同采收期對(duì)益母草生物堿的影響，本研究以采自新疆布爾津縣的益母草為考察對(duì)象，分別于盛葉期、花初期、花盛期、果初期、果熟期采集樣品，按照上述測(cè)定方法進(jìn)行總生物堿及鹽酸水蘇堿的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

1．7 不同部位益母草生物堿的比較

為了考察益母草中生物堿的分布情況，本研究對(duì)花初期、花盛期、果熟期的益母草，對(duì)莖、葉、花序、果實(shí)等部位進(jìn)行了總生物堿及鹽酸水蘇堿的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 不同采收期益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表2 不同采收期益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產(chǎn)地 品種 采收期 總生物堿/%水蘇堿/%新疆布爾津縣 益母草全草盛葉期(6月初)2．73 ±0．06 1．84 ±0．08花初期(6 月中)2．42 ±0．07 1．58 ±0．06花盛期(6 月底)1．71 ±0．05 0．93 ±0．02果初期(7 月中)1．15 ±0．03 0．67 ±0．02果熟期(7月底)0．59 ±0．03 0．33 ±0．02

表3 不同部位益母草生物堿比較( ± s，n=3)

表3 不同部位益母草生物堿比較( ± s，n=3)

產(chǎn)地 物候期(采收期)部位 總生物堿/% 水蘇堿/%新疆布爾津縣 花初期(6月中) 莖0．67 ±0．02 0．23 ±0．01葉 5．84 ±0．08 2．68 ±0．05花序 3．07 ±0．06 1．74 ±0．04花盛期(6月底) 莖 0．43±0．02 0．11±0．01葉 3．23 ±0．05 1．47 ±0．04花序 2．17 ±0．04 0．93 ±0．07果熟期(7月底) 莖 0．18±0．01 痕量葉 1．97 ±0．03 0．86 ±0．02果穗0．41 ±0．02 0．17 ±0．01

2 結(jié)果及討論

2．1 表1表明，不同產(chǎn)地野生益母草中含生物堿量差異較大。可見(jiàn)，產(chǎn)地對(duì)益母草藥材質(zhì)量影響較大，提示在挑選益母草藥材時(shí)應(yīng)盡量考慮這一因素。由于條件所限，本研究?jī)H能夠?qū)π陆?nèi)部分地區(qū)的野生益母草進(jìn)行跟蹤采集，無(wú)法對(duì)其他省市的益母草樣品進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。

2．2 比較我國(guó)幾個(gè)主要藥材市場(chǎng)銷售的益母草質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)生物堿含有量高低順序?yàn)?河北安國(guó)藥材市場(chǎng)＞黑龍江雞西藥材市場(chǎng)＞安徽亳州藥材市場(chǎng)＞浙江磐安藥材市場(chǎng)＞廣州清平藥材市場(chǎng)＞廣西玉林藥材市場(chǎng)，其中后二者鹽酸水蘇堿的量均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)。與本研究所采集的新鮮益母草相比，購(gòu)于藥材市場(chǎng)的益母草生物堿量明顯偏低，可能與益母草藥材的儲(chǔ)存時(shí)間有較大關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。

2．3 表1顯示新疆地區(qū)的益母草品種較為多樣，并對(duì)同一生長(zhǎng)期采集的不同品種益母草樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)益母草含有量最高，細(xì)葉益母草次之，白花益母草最低且均低于藥典標(biāo)準(zhǔn)?？梢?jiàn)，品種對(duì)益母草中生物堿含有量的影響也比較大，藥材種植及采收時(shí)應(yīng)予以足夠重視。

2．4 表2結(jié)果表明，不同采收期益母草的生物堿差別較大，以盛葉期與花初期的含有量最高，且隨著益母草的繼續(xù)生長(zhǎng)，生物堿量逐漸下降，至果熟期時(shí)其生物堿量?jī)H為花初期的1/5。提示各地在采收益母草藥材時(shí)，應(yīng)在花初期時(shí)進(jìn)行采收，即莖葉生長(zhǎng)旺盛，花剛開(kāi)放的時(shí)候。

2．5 表3結(jié)果表明，不同部位益母草生物堿含有量差別較大。其中，花初期時(shí)，以葉中生物堿最高，花序次之，莖最低;至花盛期時(shí)，各個(gè)部位的生物堿均明顯降低，但仍以葉最高;至果熟期時(shí)，各個(gè)部位的生物堿降低更為明顯，莖中生物堿甚至難以檢測(cè)到。提示益母草藥材以葉多、花序多為佳，個(gè)大莖粗并不代表其品質(zhì)好。

2．6 表3中益母草的葉和花序的生物堿含有量相對(duì)較高，經(jīng)分析，益母草葉質(zhì)量占全草的35%左右，花序?yàn)?%左右，而益母草的莖占60%左右，但由于其生物堿含有量相對(duì)較低，故表2中全草中的生物堿量也相對(duì)較低。這也提示益母草的最佳采收期應(yīng)在盛葉期至花初期。

［1］阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠，等．益母草的化學(xué)、藥理和臨床研究進(jìn)展［J］．中草藥，2003，34(11):15-19．

［2］樓之岑，沈 圓．益母草的生藥學(xué)研究［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1954，2(2):129-138．

［3］可 燕，車生泉．不同產(chǎn)地益母草總生物堿含量的比較［J］．中草藥，1999，30(4):270-271．

［4］范美華，王健鑫，李 鵬，等．益母草的研究進(jìn)展［J］．中藥藥物與臨床，2006，6(7):528．

［5］張 嫻，彭國(guó)平．益母草屬化學(xué)成分研究進(jìn)展［J］．天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2003，15(2):162．

［6］金 陽(yáng)．法測(cè)定復(fù)方益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量［J］．現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(6):53．

［7］國(guó)家藥典委員會(huì)．中國(guó)藥典:2010年版一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:272．

［8］徐履琴．用硫代氰酸鉻銨剩余比色法測(cè)定益母草中生物堿［J］．中草藥，1985(11):7-8．

［9］盧日剛．分光光度法測(cè)定益母草沖劑中生物堿的含量［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1986，21(9):522-524．

［10］周世玉，徐智明．薄層掃描法測(cè)定益母草膏中鹽酸水蘇堿的含量［J］．華西藥學(xué)雜志，1999，14(5-6):395-396．

［11］楊雪萍，何召允．HPLC法測(cè)定安宮止血顆粒中鹽酸水蘇堿的含量［J］．江西中醫(yī)藥，2007，38(2):51．

［12］嚴(yán)優(yōu)芍，李衛(wèi)民，高 英，等．HPLC法測(cè)定益母草不同制劑中水蘇堿［J］．中草藥，2006，37(1):70-72．