蘇鉅年， 賴(lài)永長(zhǎng)，皮 婷， 薛小燕， 林煉峰， 羅煥敏，，3*

(1．暨南大學(xué)藥學(xué)院神經(jīng)藥理研究室 廣東 廣州510632;2．暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系 廣東 廣州510632;3．暨南大學(xué)-香港大學(xué)腦功能與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632)

何首烏含有二苯乙烯苷類(lèi)、蒽醌類(lèi)化合物等，具有抗氧化、抗衰老、保肝、調(diào)節(jié)免疫和降血脂等方面的生物學(xué)活性［1］。當(dāng)前何首烏的研究大多都是集中在二苯乙烯苷類(lèi)化合物的抗氧化和對(duì)神經(jīng)作用的特性上［2］，特別是何首烏的其他主要成分是否具有神經(jīng)方面作用尚未闡明，大黃素甲醚作為何首烏蒽醌類(lèi)化合物的成分之一，對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用，提示可對(duì)大黃素甲醚的神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)作用作進(jìn)一步研究。本研究采用無(wú)血清體外培養(yǎng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元來(lái)觀察大黃素甲醚對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元的存活及促突起生長(zhǎng)的作用，以闡明其是否具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。

1 材料

1．1 藥品與試劑 DMSO(北京鼎國(guó));大黃素甲醚(中國(guó)藥品生物制品檢定所);DMEM/F12(美國(guó)Gibco);B27添加劑(美國(guó)Gibco);多聚賴(lài)氨酸(相對(duì)分子量7～15萬(wàn)，美國(guó)Sigma);胰蛋白酶(美國(guó)Amersco);MTT(美國(guó)Sigma);胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技);單克隆兔抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE，武漢博士德);單克隆小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白2(MAP2，美國(guó)Sigma);牛血清白蛋白(BSA)(博大泰克);即用型SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德);RT-PCR試劑盒(TaKaRa，批號(hào):DRR019A);DNA Marker(TaKaRa);腺苷受體抑制劑 ZM241385(Tocris Bioscience，批號(hào):13A/100775);酪氨酸激酶抑制劑 K252a(美國(guó) Sigma，批號(hào):BCBB3202)，其余試劑、藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1．2 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雌、雄SD大鼠，2～3月齡，體質(zhì)量約200g，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)2007A003。

1．3 主要儀器 SW-CJ-1F型超凈臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備)，IX71倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，24孔板、96孔板(美國(guó)Corning)，培養(yǎng)箱(英國(guó)Galaxy S)，酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)。

2 方法

2．1 分離及培養(yǎng)方法 參考 Brewer等的方法［3-5］，取12 h內(nèi)新生大鼠，75%酒精中浸泡消毒20s。超凈臺(tái)內(nèi)分離出大腦皮質(zhì)，剝離腦膜并去除海馬，D-hanks中浸洗，將其剪成約1 mm3大小，加入0．25%胰蛋白酶后35℃中消化，10min后用含有10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。過(guò)濾、離心后取得神經(jīng)元，含0．4%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基吹散細(xì)胞后用臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目，制成所需細(xì)胞濃度的均勻細(xì)胞懸浮液，在預(yù)先用0．1 mg/mL的多聚賴(lài)氨酸處理的孔板中接種神經(jīng)元。接種后于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2 神經(jīng)元的鑒定 神經(jīng)元培養(yǎng)48 h，加入4%多聚甲醛固定，PBS漂洗后加入30%H2O2與純甲醇(1∶50)浸泡20 min，PBS漂洗后滴加山羊血清封閉液，孵育20 min，棄去上清液。加入1∶80的一抗PBS液，4℃濕盒內(nèi)放置12 h。PBS漂洗，用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫放置20 min，PBS漂洗，加入 SABC，置于濕盒中20 min后用PBS漂洗，再用DAB顯色，PBS漂洗后鏡下觀察并拍照。

2．3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性 0．4%B27的 DMEM/F12培養(yǎng)基制成濃度為8×106細(xì)胞/mL的神經(jīng)元細(xì)胞懸液，于預(yù)先多聚賴(lài)氨酸處理的96孔板中每孔100μL接種，4 h后換液同時(shí)加入終質(zhì)量濃度0．5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4μmol/L大黃酸甲醚，并設(shè)定溶媒對(duì)照組和質(zhì)量濃度10 ng/mL bFGF的陽(yáng)性對(duì)照組。置于培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入MTT(5 mg/mL DMEM/F12)100μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄清培養(yǎng)液，加入200μL二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩至晶體完全溶解，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下讀取各孔吸光度值(A)［6］。每個(gè)組6個(gè)復(fù)孔，計(jì)算其平均值。

2．4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經(jīng)元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設(shè)立溶媒對(duì)照組和10 ng/mL bFGF陽(yáng)性對(duì)照組。加藥72 h后，在顯微鏡(×400)下觀察各組神經(jīng)元生長(zhǎng)情況，以胞體有光暈、長(zhǎng)出突起的神經(jīng)元為記錄對(duì)象，每孔隨機(jī)選取12個(gè)視野，每組4個(gè)復(fù)孔。用Image-pro plus6．0圖像分析軟件處理照片，測(cè)量出每組神經(jīng)元平均突起長(zhǎng)度［7-9］。

2．5 神經(jīng)元RNA樣品的制備 大黃素甲醚溶解于DMSO，作用于神經(jīng)元，使終濃度為1、2、4μmol/L，另設(shè)立溶媒對(duì)照組和終濃度10 ng/mL bFGF組。培養(yǎng)4 d后，棄去培養(yǎng)液，每組加1 mL TRIzol裂解，再加200μL三氯甲烷混勻，高速離心(10 000×g，15 min)，取其上清液，加等體積異丙醇混勻后離心沉淀(10 000×g，10 min)，加入75%乙醇洗滌沉淀，超凈臺(tái)內(nèi)晾干沉淀，加DEPC水溶解RNA。

2．6 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank的序列，Primer5．0軟件設(shè)計(jì)大鼠GADPH和MAP-2的引物(見(jiàn)表1)，引物均委托英濰捷基(上海)貿(mào)易公司合成。

表1 大鼠MAP-2和GADPH的引物序列

2．7 測(cè)定 參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行神經(jīng)元MAP-2、GADPH mRNA量的測(cè)定、cDNA合成及PCR擴(kuò)增。

2．8 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究 按如下分組:K252a 100 nmol/L，ZM241385 20 nmol/L，大黃素甲醚 2 μmol/L，K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚 2μmol/L，ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L，溶媒對(duì)照組。分別作用于神經(jīng)元，加藥48 h 后按2．4 項(xiàng)方法處理［10-11］。

3 結(jié)果

3．1 體外培養(yǎng)大鼠大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察和鑒定 新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元?jiǎng)偨臃N時(shí)胞體較小呈圓形，懸浮并均勻散布;接種4 h后開(kāi)始貼壁，神經(jīng)元分布均勻，多數(shù)神經(jīng)元為圓形，少量細(xì)胞長(zhǎng)出微小的突起。有少量的細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞，更換培養(yǎng)基的方法除去未貼壁的神經(jīng)元、紅細(xì)胞和細(xì)胞碎片。培養(yǎng)24 h后有突起的細(xì)胞明顯增多，胞體變大，突起延長(zhǎng)但仍較短小。培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞胞體明顯增大，多數(shù)呈梭形或圓梭形，每個(gè)細(xì)胞有2～4個(gè)突起，突起長(zhǎng)度明顯增加，開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)網(wǎng)格。利用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定法鑒定接種48h的細(xì)胞，結(jié)果顯示NSE陽(yáng)性細(xì)胞占絕大多數(shù)，見(jiàn)圖1，表明絕大多數(shù)細(xì)胞(＞97%)是神經(jīng)元。

圖1 新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

3．2 不同濃度藥物干預(yù)對(duì)神經(jīng)元存活的影響 MTT法檢測(cè)顯示，在該培養(yǎng)條件下，大黃素甲醚各劑量組均可顯著提高細(xì)胞活性，表明大黃素甲醚能促進(jìn)神經(jīng)元的存活(見(jiàn)表2)。

表2 大黃素甲醚對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元活性的影響 ( ± s，n=6)

表2 大黃素甲醚對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元活性的影響 ( ± s，n=6)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 A值溶媒對(duì)照組0．1% 0．088 2 ±0．003 2 bFGF 組 10 ng/mL 0．153 2 ±0．012 3＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 0．100 4 ±0．006 6＊＊1 μmol/L 0．115 8 ±0．008 0＊＊2 μmol/L 0．122 6 ±0．014 4＊＊4 μmol/L 0．124 2 ±0．011 3＊＊

3．3 形態(tài)學(xué)定量分析 加藥后72 h后，大黃素甲醚各劑量組突起長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，與溶媒對(duì)照組相比，均有顯著性差異(P＜0．01)，各劑量組與 bFGF組之間無(wú)明顯差異(P＞0．18)。見(jiàn)表3，圖2(A ～E)。

表3 大黃素甲醚對(duì)培養(yǎng)72 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=4)

表3 大黃素甲醚對(duì)培養(yǎng)72 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=4)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

組別 藥物劑量 平均突起長(zhǎng)度/μm溶媒對(duì)照組0．1% 181．723 1 ±65．600 9 bFGF 組 10 ng/mL 318．551 9 ±72．689 6＊＊大黃素甲醚組 1 μL/mL 273．110 5±51．771 0＊＊2 μL/mL 289．727 8 ±51．791 7＊＊4 μL/mL 268．982 4 ±50．771 5＊＊

3．4 大黃素甲醚對(duì)大腦皮層神經(jīng)元MAP-2 mRNA表達(dá)的影響 從表4和圖3中可看出，0．5μmol/L、2μmol/L、4μmol/L大黃素甲醚組MAP-2 mRNA與內(nèi)參基因GADPH mRNA的含量百分比值較溶媒對(duì)照組顯著上升(P＜0．01)。

3．5 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究 從表5中看出，K252a 100 nmol/L組或K252a 100 nmol/L+大黃素甲醚2 μmol/L組與溶媒組比較，突起長(zhǎng)度無(wú)明顯變化(P＞0．05);ZM241385 20nmol/L組與溶媒組比較能縮短突起長(zhǎng)度(P＜0．01);大黃素甲醚2μmol/L組或ZM241385 20 nmol/L+大黃素甲醚2μmol/L組與溶媒組比較，能增加突起長(zhǎng)度(P＜0．01)，且兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0．05)。

A．DMSO溶媒對(duì)照組 B．大黃素甲醚1μmol/L組 C．大黃素甲醚2μmol/L組D．大黃素甲醚4μmol/L組 E．bFGF 10ng/mL組 標(biāo)尺為50μmol/L

表4 大黃素甲醚對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

表4 大黃素甲醚對(duì)大鼠大腦皮層神經(jīng)元MAP2 mRNA量的影響 ( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01

組別 藥物劑量 MAP-2/GADPH(%)溶媒對(duì)照組0．1% 2．34 ±0．12 bFGF 組 10 ng/mL 36．12 ±3．04＊＊大黃素甲醚組 0．5 μmol/L 23．44 ±1．38＊＊2 μmol/L 28．12 ±1．95＊＊4 μmol/L 30．50 ±2．19＊＊

圖3 凝膠電泳圖片

表5 2種抑制劑對(duì)48 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=3)

表5 2種抑制劑對(duì)48 h大鼠大腦皮層神經(jīng)元突起的影響( ± s，n=3)

注:與溶媒組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01;與大黃素甲醚組比較，#P ＜0．05，##P ＜0．01

組別 藥物劑量 平均突起長(zhǎng)度/μm溶媒對(duì)照組 0．2% 100．76 ±15．62##大黃素甲醚 2 μmol/L 158．46±36．81＊＊K252a+大黃素甲醚組100 nmol/L+2 μmol/L 104．27 ±15．91##K252a 100 nmol/L 105．25 ±20．78##ZM241385+大黃素甲醚組20 nmol/L+2 μmol/L 147．15 ±57．53＊＊ZM241385 20 nmol/L 74．10 ±23．85＊＊##

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為“腎生髓，腦為髓?！保澳I”與腦功能存在密切的聯(lián)系。通過(guò)補(bǔ)腎添髓可以防治衰老引起的記憶力下降。何首烏味苦、甘、澀，性溫。歸肝、腎經(jīng)?！堕_(kāi)寶本草》中說(shuō)其:“益氣血，黑髭鬢，悅顏色。久服長(zhǎng)筋骨，益精髓延年不老”。具有補(bǔ)益精血、澀精止遺、補(bǔ)益肝腎的作用。自古何首烏就被當(dāng)成延年益智的藥物。大黃素甲醚為何首烏的主要成分之一，本實(shí)驗(yàn)觀察大黃素甲醚對(duì)體外培養(yǎng)的新生大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)及存活的影響。形態(tài)學(xué)定量分析，細(xì)胞活性測(cè)定和MAP-2mRNA表達(dá)量的測(cè)定結(jié)果顯示，與溶媒對(duì)照組相比，1～4μmol/L組均可以提高細(xì)胞活力、促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng)(P＜0．01);bFGF與1～4μmol/L加藥組相比，對(duì)神經(jīng)元突起長(zhǎng)度的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．3);MAP2 mRNA電泳顯示，各加藥組和bFGF組與溶媒對(duì)照組相比，能明顯增加MAP-2 mRNA表達(dá)的量(P＜0．01)，表明大黃素甲醚具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。在形態(tài)學(xué)分析中，可能是由于4μmol/L組存活的細(xì)胞較多，每個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)的空間較少，抑制突觸的生長(zhǎng)，以致4μmol/L組比2μmol/L組的平均突起長(zhǎng)度略短。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用機(jī)制的初步研究中發(fā)現(xiàn)，加入腺苷受體抑制劑不能阻斷大黃素甲醚促進(jìn)對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比P＞0．05);而加入酪氨酸激酶抑制劑能阻斷大黃素甲醚促進(jìn)對(duì)神經(jīng)元突起生長(zhǎng)的作用(與大黃素甲醚2μmol/L相比 P＜0．01)。提示大黃素甲醚可能是通過(guò)直接或間接激活Trk受體起營(yíng)養(yǎng)作用，而非通過(guò)腺苷受體起營(yíng)養(yǎng)作用。

神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森綜合癥、亨廷頓病等，都與神經(jīng)突起和神經(jīng)元的丟失相關(guān)，主要因?yàn)樯窠?jīng)元缺乏營(yíng)養(yǎng)或受到有害物質(zhì)損傷引起。

內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族如NGF、BDNF等，在神經(jīng)元生長(zhǎng)、存活、分化，調(diào)節(jié)突觸可塑性方面具有重要［12-13］。但外源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺點(diǎn)也比較突出，如分子量大、不易透過(guò)血腦屏障、易引起疼痛等，致使它們?cè)谂R床應(yīng)用過(guò)程中受到很多限制。近年研究表明，有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子類(lèi)似作用的小分子物質(zhì)有預(yù)防突觸丟失、突起損傷的作用，具有治療神經(jīng)退行性變的潛力。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用的小分子物質(zhì)可以克服神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的上述缺點(diǎn)，用于治療神經(jīng)退行性疾病的潛力。大黃素甲醚為小分子中藥單體，脂溶性好，具有一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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