侯 林， 田景振， 姬 濤

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟(jì)南250355)

全蝎始載于《開寶本草》，中國(guó)藥典收載的品種為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎Buthusmartensii Karsch的干燥體。辛，平;有毒。歸肝經(jīng)。具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛功能，臨床用于小兒驚風(fēng)、抽搐痙攣、中風(fēng)口?、半身不遂、破傷風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、偏正頭痛、瘡瘍、瘰癘等癥［1］。目前許多抗癌藥的成方中，全蝎常為主藥，由于有效成分不清楚，多以原粉入藥，少數(shù)用水、醇提取，全蝎的主要藥效成分為蛋白、多肽類，用常規(guī)的水醇法不能將其充分的提取而且易使其變性失活［2］。生藥粉末直接配藥存在制劑量大、水平低，無(wú)法制備高效制劑的缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用全蝎勻漿后磷酸緩沖液提取的方法，在單因素考察的基礎(chǔ)上以蛋白含有量為指標(biāo)，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了全蝎蛋白的提取工藝。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1．1 試驗(yàn)材料 全蝎藥材購(gòu)自蒙陰縣藥材公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系王厚偉副教授鑒定為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎Buthusmartensii Karsch。

1．2 試驗(yàn)儀器 日立UV-3010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司);JJ-2組織搗碎勻漿機(jī)(江蘇金壇市金偉實(shí)驗(yàn)儀器廠);LD4-2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);BS110分析天平(賽多利斯天平公司);恒溫震蕩水浴(深圳國(guó)華儀器)。

1．3 試劑 甲醇，冰醋酸、磷酸等均為分析純。

2 試驗(yàn)內(nèi)容

2．1 提取工藝 將活全蝎洗凈晾干后，冰箱凍殺，取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)使用組織搗碎機(jī)勻漿后，按不同的條件用恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取，提取液3 500 r/min離心15 min，連續(xù)提取3次，合并取上清液定容至250 mL。

2．2 樣品液的蛋白量測(cè)定［3］本部分采用280 nm光吸收測(cè)定樣品液中的蛋白量，該方法可以快速的對(duì)樣品液進(jìn)行測(cè)定，該方法不是嚴(yán)格的定量但是對(duì)于本部分的蛋白量測(cè)定是合適的。

2．2．1 原理［4］蛋白質(zhì)分子中常含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等含有苯環(huán)的氨基酸，苯環(huán)結(jié)構(gòu)在280 nm處有最大吸收，其吸收值與蛋白濃度成正比，故可以采用280 nm波長(zhǎng)吸收值的大小來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的量。

2．2．2 樣品液中的蛋白量測(cè)定方法 用試驗(yàn)用的緩沖液調(diào)零，然后分別測(cè)定樣品在280 nm和260 nm下的吸光度，按以下公式計(jì)算蛋白量［5］:

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(mg/mL)=1．55×A280－0．75×A260

2．3 提取次數(shù)考察 中藥提取過(guò)程中，提取次數(shù)是影響提取率的關(guān)鍵因素，多次提取可以最大限度的將有效成分提取出來(lái)，但多次提取必然加大了提取難度故一般提取2～3次。本部分將全蝎分別提取3次，測(cè)定第3次提取蛋白的量來(lái)確定是否進(jìn)行3次提取。

取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL的緩沖液恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取1 h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液定容至100 mL備用，分別提取3次，重復(fù)兩遍，樣品液測(cè)定吸光度并計(jì)算質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取次數(shù)考察結(jié)果

由上述結(jié)果可見(jiàn)，第3次提取的蛋白占總量的18．08%，且考慮到全蝎系貴重藥材，第3次提取應(yīng)該保留。

2．4 提取工藝單因素考察 根據(jù)經(jīng)驗(yàn)影響本工藝的因素有加水量、提取時(shí)間和NaCl的濃度，由于用本工藝提取全蝎蛋白尚未見(jiàn)報(bào)道，需通過(guò)單因素試驗(yàn)摸索其提取條件，確定各因素水平。

2．4．1 磷酸鹽緩沖液加入量考察 取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，分別加入 30、40、50、60、70、80 mL的緩沖液，2．1項(xiàng)下的工藝進(jìn)行提取，每次1 h，提取液合并后測(cè)定吸光度并計(jì)算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 磷酸鹽緩沖液加入量考察結(jié)果

2．4．2 提取時(shí)間考察 取10 g冷凍全蝎加入10mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL的緩沖液按2．1項(xiàng)下的工藝進(jìn)行提取，分別提取 0．5、1、1．5、2、2．5 h，測(cè)定吸光度并計(jì)算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間考察結(jié)果圖

2．4．3 NaCl濃度的考察 取10 g冷凍全蝎加入10 mL磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，分別加入50 mL含有1%、2%、3%、4%、5%、6%、8%NaCl的緩沖液按2．1項(xiàng)下的工藝進(jìn)行提取，每次提取1 h，測(cè)定吸光度并計(jì)算濃度，并平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 NaCl濃度考察結(jié)果圖

2．5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，確定以280 nm光吸收測(cè)定樣品液中的蛋白量為指標(biāo)，考察緩沖液加入量、提取時(shí)間、NaCl濃度三個(gè)因素對(duì)全蝎蛋白提取的影響，以L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)稱取冷凍全蝎10 g，以正交試驗(yàn)表中各水平，按2．1項(xiàng)下的流程操作，得到提取液若干，按2．2項(xiàng)下的方法測(cè)定蛋白，因素水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表3、表4。

表2 正交因素水平表

以280 nm光吸收測(cè)定樣品液中的蛋白量指標(biāo)，由表中的極差的大小顯示，各因素作用主次為:C因素(NaCl濃度)﹥B因素(提取時(shí)間)﹥A因素(PBS加入量)。表中的方差分析表明:C因素(NaCl濃度)的影響有顯著性意義。從直觀分析得知最佳提取工藝組合為:A3B3C2。但從生產(chǎn)的實(shí)際上考慮，為了節(jié)省緩沖液的用量，提高生產(chǎn)效率，采用A2B2C2，即加入5倍量的緩沖液、每次提取1 h，NaCl濃度5%，提取3次。

2．6 驗(yàn)證性試驗(yàn) 取10 g冷凍全蝎加入10mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，將蝎漿轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入50 mL含有5%NaCl的緩沖液分別恒溫振蕩器冰水浴震蕩提取1h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液備用，殘?jiān)辞胺ɡ^續(xù)提取，共提取3次，定容至250 mL，測(cè)定吸光度并計(jì)算濃度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析

表5 驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究根據(jù)蛋白質(zhì)的相關(guān)特性，利用稀鹽促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解的原理，使用低濃度的氯化鈉緩沖液對(duì)全蝎勻漿液進(jìn)行抽提，通過(guò)單因素考察試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定的最佳提取工藝為取冷凍全蝎加入等量的磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L，pH 7．2)組織搗碎機(jī)勻漿，加入5倍量含有5%NaCl的緩沖液冰水浴提取1h，提取液3 500 r/min離心15 min，取上清液備用，殘?jiān)辞胺ɡ^續(xù)提取，共提取3次。該工藝操作方便，適用性好，可以直接應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。

目前許多抗癌藥的成方中，全蝎常為主藥［6］，由于有效成分不清楚，在中成藥生產(chǎn)工藝中全蝎基本是生藥粉末直接配料，少數(shù)用水、醇回流提?。?～8］，由于全蝎的有效成分主要為蛋白類物質(zhì)及其水解產(chǎn)物，常規(guī)的水、醇提取不能充分的提出這些大分子物質(zhì)，而且經(jīng)過(guò)加熱處理使大量的蛋白類有效成分變性失活，不利于有效物質(zhì)的保留，采用生藥粉末直接配料存在制劑水平低下和微生物超標(biāo)的問(wèn)題，孟琳等［9］比較了對(duì)全蝎水提取工藝、乙醇提取工藝和勻漿提取工藝的蛋白得率以及抗驚厥藥效進(jìn)行了比較，結(jié)果證明勻漿提取工藝的蛋白得率比傳統(tǒng)提取工藝高十倍以上，抗驚厥作用也明顯強(qiáng)于傳統(tǒng)提取工藝。將勻漿提取工藝應(yīng)用與中藥全蝎的提取將解決制約含全蝎中藥制劑發(fā)展的瓶頸問(wèn)題，同時(shí)也可以應(yīng)用與其他相關(guān)動(dòng)物類中藥的提取過(guò)程中。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典2010版一部［S］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:133．

［2］譚銀合，郭建生．全蝎的化學(xué)成分及其鎮(zhèn)痛作用的研究進(jìn)展［J］．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2001，7(5):210-212．

［3］王家政，范 明主編．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)［M］．北京:科學(xué)出版社，2000:20．

［4］Wetlaufer D B．Ultratiolet spectra of proteins and amino acids［J］．Adv Prot Chem，1962:303-309．

［5］Schleif R F，Wensink P C．Pratical methods in molecularbiology［M］．New York，Springer-Ver．1981:217-219．

［6］鄭希林，張洪生．全蝎制劑的臨床應(yīng)用［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2000，11(9):853．

［7］譚銀合，曹道忠，郭建生．全蝎蝎毒蛋白的提取工藝研究［J］．湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2001，7(6):287-289．

［8］林 超，王玉蓉，吳 清，等．全蝎的酶解工藝研究［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28(6):66-69．

［9］孟 琳，姬 濤，侯 林，等．全蝎勻漿提取工藝的研究［J］．中草藥，2010，41(4):577-580．