王政潤(rùn)，于建霖，孔慶霞

小球藻細(xì)胞勻漿制備方法探究

王政潤(rùn)，于建霖，孔慶霞通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300392）

以普通小球藻為受試生物，研究了液氮?jiǎng)驖{法、研磨勻漿法、機(jī)械勻漿法、反復(fù)凍融法等4種勻漿方法的破壁效率，同時(shí)使用4種方法制備的勻漿液測(cè)定SOD活力和GSH含量，旨在篩選出破碎效率高、方便快捷且測(cè)定生理生化指標(biāo)準(zhǔn)確的方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，4種方法的破碎率分別為81.43%、100.00%、92.41%、56.54%，SOD活力分別為47.06、48.58、0、25.05 U/mgprot，其中研磨勻漿法與液氮破碎法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（＞0.05）；GSH含量分別為34.42、24.52、87.37、38.75 mgGSH/gprot，研磨勻漿法、液氮破碎法、反復(fù)凍融法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異（＞0.05），與機(jī)械勻漿法差異顯著（＜0.05）。結(jié)果說(shuō)明，研磨勻漿法和液氮破碎法的破碎率高，生化指標(biāo)測(cè)定準(zhǔn)確。但由于研磨勻漿法耗費(fèi)人工成本過(guò)高，且無(wú)法處理大量樣本，相較而言，在上述方法中采用液氮破碎法是制備小球藻細(xì)胞勻漿液最好的方法。

普通小球藻；勻漿方法；細(xì)胞破碎率；生化指標(biāo)

小球藻（）屬于綠藻門(mén)、綠球藻目、小球藻科，其中常見(jiàn)的有蛋白核小球藻（）、普通小球藻（）、海水小球藻（）等。在水生生態(tài)毒理研究中，單細(xì)胞綠藻可以直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀，是較為理想的試驗(yàn)材料，常用作急性毒性測(cè)定。小球藻是應(yīng)用最多的藻類之一，也是國(guó)家環(huán)保局推薦使用的藻類毒性測(cè)試的試驗(yàn)藻之一[1-3]。

通常，所有的毒性效應(yīng)都是開(kāi)始于毒物與生物分子的相互作用，在生化水平上生物標(biāo)記物可以用來(lái)指示毒物造成的效應(yīng)，最主要的生物標(biāo)記物是各種酶[4]。酶一般是大分子物質(zhì)，不會(huì)經(jīng)由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，需破碎細(xì)胞，將酶釋放從而測(cè)定酶的含量或活力。然而小球藻不同于其他動(dòng)植物，其具有較厚、堅(jiān)硬且成分復(fù)雜的細(xì)胞壁[5-7]，保護(hù)細(xì)胞膜不易被破壞，加大了細(xì)胞破碎和勻漿的難度，影響生化指標(biāo)測(cè)定的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室通常采取物理勻漿方法，如液氮?jiǎng)驖{法、研磨勻漿法、機(jī)械勻漿法、反復(fù)凍融法[8]等。同時(shí)，幾種物理勻漿方法之間也存在操作便捷性和生化指標(biāo)測(cè)定準(zhǔn)確性的差異，因此，亟待在現(xiàn)有方法中篩選一種高效、經(jīng)濟(jì)的小球藻勻漿液制備方法。

本文以普通小球藻為試驗(yàn)對(duì)象，分別對(duì)幾種物理勻漿方法進(jìn)行比較，并通過(guò)比較超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）的測(cè)定結(jié)果，篩選出1種最為合適的小球藻勻漿液制備方法。

1 材料與方法

1.1 材料

普通小球藻（）取自天津農(nóng)學(xué)院海洋漁業(yè)資源實(shí)驗(yàn)室，使用f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基在使用前用高壓滅菌器（HVE50，平山制作所株式會(huì)社）121℃滅菌20 min。小球藻置入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)光暗比14 h∶10 h，溫度（24±1）℃，相對(duì)濕度38%，光照強(qiáng)度50 μmol/（m2·s）。取20 mL藻液，因勻漿方法差異，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜抽濾，取截留藻細(xì)胞的濾膜，或4 000 r/min離心10 min，棄上清取沉淀的藻細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞勻漿

藻細(xì)胞勻漿液按照以下操作制備。

1.2.1.1液氮?jiǎng)驖{法

將含有藻細(xì)胞的濾膜置于研缽中，加入20 mL液氮，用搗杵將濾膜碾成粉末狀，加入2 mL生理鹽水。

1.2.1.2 研磨勻漿法

將2 mL生理鹽水加入離心收集的藻細(xì)胞中，置于研缽中，加入1 g石英砂，冰水浴條件下研磨30 min。

1.2.1.3 機(jī)械勻漿法

將2 mL生理鹽水加入離心收集的藻細(xì)胞中，加入20顆直徑為2 mm的鋼珠，用高通量組織研磨儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）處理3 min，頻率68 000 Hz。

1.2.1.4 反復(fù)凍融法

將2 mL生理鹽水加入離心收集的藻細(xì)胞中，置于-20 ℃冰箱冷凍；待完全凍結(jié)后取出解凍，解凍一半時(shí)用渦旋混合器震蕩，融化后重復(fù)冷凍操作，共計(jì)3次。

1.2.2 細(xì)胞破碎率的測(cè)定

取200 μL勻漿液注入血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)池中，蓋上蓋玻片，在生物顯微鏡（BX53，OLYMPUS）下觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)完整細(xì)胞數(shù)。每種勻漿液重復(fù)計(jì)數(shù)3次。

1.2.3 生化指標(biāo)的測(cè)定

將制備的勻漿液2 500 r/min 離心10 min，取上清液用于測(cè)定生化指標(biāo)。

通過(guò)黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力。藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，在550 nm處測(cè)定其吸光度。超氧化物歧化酶活力指的是每毫克組織蛋白在1 mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）。

通過(guò)分光光度法測(cè)定GSH含量。含巰基的化合物與5，5＇-二硫代-雙-（2-硝基苯甲酸）（TDNB）在pH＝7時(shí)反應(yīng)生成黃色的2-硝基-5-巰基苯甲酸，其顏色深淺與GSH的濃度成線性關(guān)系，在412 nm處具有最大吸收。細(xì)胞內(nèi)GSH含量指的是毫克谷胱甘肽每克蛋白（mgGSH/gprot）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及單因素方差分析，Excel 2007繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同破碎方法效果比較

圖1-a與圖1-b是液氮?jiǎng)驖{法、研磨勻漿法制取的勻漿液40倍鏡照片，圖1-c與圖1-d是機(jī)械勻漿法、反復(fù)凍融法制取的勻漿液20倍鏡照片。圖1-a中黑色不規(guī)則形狀是濾膜碎屑，該視野未見(jiàn)完整藻細(xì)胞。圖1-b只能看清血球計(jì)數(shù)板的網(wǎng)格線，視野中的白色為研磨后粉末狀的石英砂。圖1-c中黑色圖案是小鋼珠碎屑，該視野未見(jiàn)完整藻細(xì)胞。圖1-d可見(jiàn)較多完整藻細(xì)胞。通過(guò)計(jì)數(shù)，4種方法平均破碎率為：液氮?jiǎng)驖{法81.43%，研磨勻漿法100.00%，機(jī)械勻漿法92.41%，反復(fù)凍融法56.54%。

注：圖1-a和1-b放大倍數(shù)為40倍，圖1-c和1-d放大倍數(shù)為20倍。a，液氮?jiǎng)驖{法；b，研磨勻漿法；c，機(jī)械勻漿法；d，反復(fù)凍融法

2.2 SOD含量比較

如圖2所示，4種勻漿方法中液氮?jiǎng)驖{法和研磨勻漿法小球藻的SOD活力（47.06、48.58 U/mgprot）顯著高于其他兩種勻漿方法，其他兩種勻漿方法小球藻的SOD活性由高到低依次為反復(fù)凍融法25.05 U/mgprot，機(jī)械勻漿法0 U/mgprot。液氮?jiǎng)驖{法和研磨勻漿法之間差異不顯著（＞ 0.05），但顯著高于其他兩種方法（＜0.05）。

2.3 GSH含量比較

如圖3所示，機(jī)械勻漿法小球藻的GSH含量（87.37 mgGSH/gprot）顯著高于其他勻漿方法。液氮?jiǎng)驖{法（34.42 mgGSH/gprot）、研磨勻漿法（24.52 mgGSH/gprot）和反復(fù)凍融法（38.75 mgGSH/gprot）之間差異不顯著（＞0.05），與機(jī)械勻漿法差異顯著（＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

目前，有很多單細(xì)胞藻類的勻漿方法，物理方法包括研磨勻漿法[9]、機(jī)械勻漿法[10]、超聲法[11]、微波法[12]等；化學(xué)方法包括有機(jī)溶劑法[13]、強(qiáng)酸浸提法[14]、強(qiáng)堿浸提法[15]等；生物方法包括細(xì)菌法[16]、酶解法[16]、病毒法[17]等。酶解法原理是纖維素酶快速地分解藻類細(xì)胞壁，使胞內(nèi)物質(zhì)容易釋放。酶解法可以一次處理大量樣本，但經(jīng)濟(jì)成本較高；化學(xué)方法破壁效果好，但胞內(nèi)酶及活性物質(zhì)易被破壞；物理方法破壁操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞活性物質(zhì)破壞小，是實(shí)驗(yàn)室通常采用的手段。本試驗(yàn)通過(guò)比較幾種物理方法，發(fā)現(xiàn)研磨勻漿法破壁率最高，經(jīng)30 min研磨破碎率接近100%；機(jī)械勻漿法達(dá)到90%以上；反復(fù)凍融法接近50%。綜合考慮破碎效率、經(jīng)濟(jì)成本、耗費(fèi)人力等因素，液氮?jiǎng)驖{法破壁速度快、效率高，30 s即可達(dá)到80%的破碎率，是物理方法的最佳選擇；研磨勻漿法要獲得較高的破碎率，需要耗費(fèi)大量時(shí)間，人工成本巨大，且無(wú)法處理大量樣本；機(jī)械勻漿法購(gòu)置儀器成本較大；反復(fù)凍融法的破壁效果因凍融次數(shù)而異，也可以處理大量樣本，但耗費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)。

細(xì)胞受到脅迫產(chǎn)生活性氧自由基，如O2-·、·OH等，可破壞生物大分子，影響細(xì)胞活 性[18-19]。酶類抗氧化劑和低分子清除劑是清除自由基的主要物質(zhì)，保護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD與GSH是重要代表。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)清除超氧陰離子（O2-·）的特異性酶，將其分解為H2O2和O2，是生物體抗氧化的第一道防線[20-21]；還原型谷胱甘肽可以清除對(duì)生物體仍有損傷的H2O2，同時(shí)也是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（GST）的底物，對(duì)機(jī)體抗氧化平衡起到巨大作用[22]。從圖2的SOD活力可以看出，研磨勻漿法和液氮?jiǎng)驖{法測(cè)定出的結(jié)果相近，F(xiàn)檢驗(yàn)表明無(wú)顯著差異（＞0.05），說(shuō)明大分子物質(zhì)從細(xì)胞進(jìn)入到勻漿液中，可被檢測(cè)且蛋白結(jié)構(gòu)未被破壞，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。李琦等[23]研究了反復(fù)凍融對(duì)嗜熱鏈球菌SP1.1的β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力的影響，測(cè)定結(jié)果僅為0.0656 U、0.897 U，而使用酶解法測(cè)定結(jié)果為0.387 U、2.375 U，差異顯著（＜0.05）。本試驗(yàn)中反復(fù)凍融法的測(cè)定結(jié)果約為其他方法一半，可能是因?yàn)榉磸?fù)凍融對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響。機(jī)械勻漿法未檢測(cè)出SOD，原因可能是巨大剪切力使蛋白質(zhì)變性，且勻漿過(guò)程中無(wú)法保證低溫，導(dǎo)致SOD失活。從圖3可以看出，液氮?jiǎng)驖{法、研磨勻漿法和反復(fù)凍融法小球藻的GSH含量差別不明顯，機(jī)械勻漿法使GSH含量大幅增加，原因可能是細(xì)胞內(nèi)的其他酶或蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象被破壞，勻漿液中半胱氨酸或含半胱氨酸的多肽含量上升[24]，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏高。

結(jié)合破壁效果、便捷性、經(jīng)濟(jì)性、生化指標(biāo)測(cè)定的準(zhǔn)確性等因素，作者認(rèn)為液氮?jiǎng)驖{法是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定的最佳方法。如果不方便獲取液氮，可以采用反復(fù)凍融法并增加凍融次數(shù)。

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Study on the preparation methods of homogenate chlorella cells

Wang Zhengrun, Yu Jianlin, Kong QingxiaCorrespondingAuthor

（College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

Withas the test organism, four homogenizate methods ,liquid nitrogen method, grinding method, mechanical method, and repeated freeze-thaw method were studied. The homogenation with the above methods was used to determined the SOD activity and GSH content, which aimed to select a method with high crushing efficiency, convenience, and accurate determination of physiological and biochemical indicators. The results showed that the crushing rates of the four methods were 81.43%, 100%, 92.41%, 56.54%, and the SOD activity were 47.06, 48.58, 0, 25.05 U/mgprot. There was no significant difference between liquid nitrogen method and grinding method（＞0.05）; GSH content were 34.42, 24.52, 87.37, 38.75 mgGSH/gprot; There was no significant difference apart of mechanical method（＞0.05）. The above results indicated that the grinding method and liquid nitrogen method have a high crushing rate, and accurate measurement of the biochemical indicators. However, grinding method consumed too much labor and cannot process a large number of samples, so the liquid nitrogen method was considered to be the best solution for preparing microalgal cell homogenation.

; homogenate methods; crushing rate; biochemical indicators

1008-5394（2021）03-0065-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.014

X55

A

2020-01-15

天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系尾水處理崗位（ITTFR2018047）；天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目（無(wú)編號(hào)）

王政潤(rùn)（1995—），男，碩士在讀，主要從事環(huán)境毒理學(xué)方面的研究。E-mail：305179091@qq.com。

孔慶霞（1978—），女，副教授，博士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)方面的研究。E-mail：xiaokong3155@163.com。

責(zé)任編輯：張愛(ài)婷