楊雪梅，茍攀寧，張云翔，陸雪蘭，賀艷婷，田小衛(wèi)

車前子內生細菌的分離、鑒定及生防作用研究

楊雪梅，茍攀寧，張云翔，陸雪蘭，賀艷婷，田小衛(wèi)通信作者

（天津農學院 園藝園林學院，天津 300392）

近年來，植物病蟲害的生物防治受到人們廣泛關注。為了豐富防治植物病害的拮抗微生物資源，本研究選用中草藥——車前子為試驗材料，對其內生拮抗細菌進行分離，以蘋果腐爛病菌（）、番茄早疫病菌（）、小麥赤霉病菌（）、黃瓜白粉病菌（）和草莓灰霉病菌（）為供試病菌，測定其抑菌活性。結果表明，從車前子的不同器官(根、莖、葉、花序)中共分離出20株內生細菌，有5株內生細菌對供試病原菌表現(xiàn)出一定程度的抑制作用，其中R-6菌株的抑菌活性最強，其對草莓灰霉病和黃瓜白粉病的保護和治療作用分別達到56.9%、50.5% 和49.0%、37.3%。應用形態(tài)學、生理生化特性及分子生物學技術對R-6進行了鑒定，初步鑒定R-6菌株為貝萊斯芽孢桿菌（）。

車前子；內生細菌；篩選；鑒定；生防作用

隨著我國保護地栽培面積不斷增加，植物病害的發(fā)生呈逐年加重的趨勢，嚴重影響了農作物生產和農產品質量安全。由于化學農藥成本低、見效快、使用方便，目前依舊是植物病害防治的主要途徑，但是由于過度使用化學農藥，導致了農藥殘留、環(huán)境污染、病原菌抗藥性等一系列問題。許多發(fā)達國家相繼開始了生物農藥、綠色農藥的研究和開發(fā)，我國也提出了以生物防治為主導的綠色防控理念，推動農業(yè)由增產導向轉向提質導向，大力發(fā)展綠色優(yōu)質農產品生產，因此植物病害生物防治的研究越來越受到人們重視。

植物內生菌是指在其生活史的一定階段或者全部階段生活在健康植物的各種器官和組織內部,宿主植物在短期內不會由于這些菌類的存在而表現(xiàn)出外在的癥狀，包括內生細菌、內生真菌及內生放線菌等[1]。1992年KLOEPPER等提出了植物內生菌的概念[2]。1993年STIERLE等[3]從短葉紅豆杉（）的樹皮中分離到一株內生真菌（），能產生抗腫瘤化合物紫杉醇，引起了巨大轟動，自此便打開了植物內生菌資源庫研究的大門。目前研究表明，植物內生菌普遍存在于植物體內，與寄主植物在長期進化過程中形成了和諧關系，具有抗病蟲害、促生、內生固氮、殺線蟲等作用[4]。例如從花生中分離的內生細菌LDO2對植物具有促生和抑制病菌的作用[5]；從蕨類植物問荊中分離的內生細菌對微生物金黃葡萄球菌和大腸桿菌具有強烈的抑菌活性[6]；棉花內生細菌在溫室條件下對美洲棉鈴蟲具有較好的防治效果[7]。

車前子（）是車前科車前屬的一種多年生草本植物，耐寒，喜溫暖濕潤環(huán)境。作為一味常用的中草藥材，車前子具有利尿、滲濕止瀉、清熱化痰和清肝明目等藥用價值。國內關于車前子內生菌的抗菌物質研究比較少，大多集中在其中藥藥理方面的研究。因此本試驗對車前子內生菌的抑菌活性進行研究，以期篩選出具有抑菌活性的菌株，為尋找對植物病害具有良好生防前景的菌株奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

車前子的根、莖、葉、花莖、花序等組織，于2017年7月10日采自天津農學院試驗田內。

黃瓜品種：津春4號。草莓品種：市場采購，品種未知。

1.1.2 供試植物病原菌

本試驗應用的病原菌分別為蘋果腐爛病菌（）、番茄早疫病菌（）、小麥赤霉病菌（）、草莓灰霉病菌（）、黃瓜白粉病菌（）。以上供試菌株均由天津農學院園藝園林學院植物病理學實驗室提供。

1.1.3 本試驗所用培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基用于內生細菌的分離培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基用于內生細菌發(fā)酵，PDA培養(yǎng)基用于培養(yǎng)病原真菌和抑菌活性測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 車前子內生細菌的分離與純化

車前子內生細菌的分離純化見參考文獻[8]。劃線培養(yǎng)，挑取單菌落進行分離純化。

1.2.2 內生細菌抑菌活性測定

對分離獲得的內生細菌，應用對峙法進行初篩，采用生長速率法、活體組織法、盆栽法對其抑菌活性進行驗證。

對峙法：在PDA平板中央接種一直徑5 mm病原菌菌餅，同時挑取待測細菌菌株點于平板邊緣約1.5 cm處，28 ℃黑暗培養(yǎng)5～7 d，測量抑菌帶距離，每處理重復3次。并設空白對照。

生長速率法：將R-6發(fā)酵液采用0.22 μm濾芯過濾后加入滅菌后的PDA固體培養(yǎng)基中混勻，將15 mL培養(yǎng)基倒入滅菌平皿中。待培養(yǎng)基凝固后，將培養(yǎng)好的病原菌打成直徑為5 mm 的菌餅貼于平皿中，使有菌絲面朝下，陰性對照為PDA 固體培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)。72 h檢查結果，測定菌落直徑。

活體組織法：

（1）保護作用：選取新鮮、大小均一的草莓果實（帶蒂），清洗晾干，將R-6菌株發(fā)酵液噴于草莓表面，放入底部有滅菌濕潤濾紙的燒杯中密封，24 h后接種草莓灰霉病菌餅。在接種時使用無菌接種針輕輕刺破草莓表面，將直徑為5 mm的草莓灰霉菌餅反接于草莓果實表面的破口處，并置于25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，5～7 d后測定病斑直徑，計算抑菌率。設清水處理為對照。

（2）治療作用：治療作用與保護作用的測定方法基本一致，但區(qū)別是先接種草莓灰霉病菌餅，24 h后再噴施R-6菌株菌液[8]。

盆栽法：盆栽法和活體組織法的試驗方法基本相同。盆栽幼苗為黃瓜三葉期幼苗，制備黃瓜白粉病菌分生孢子懸浮液，濃度為15×10倍顯微鏡下每個視野30～40個孢子，噴霧接種黃瓜白粉病菌，用發(fā)酵液噴灑處理3次，每次處理間隔7 d，最后調查病情指數(shù)和計算防效。

1.2.3 計算方法

病情指數(shù)、防治效果、抑制率計算公式如下：

1.2.4 內生細菌的初步鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學觀察

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，待單菌落長出后，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色、邊緣以及隆起程度等。進行革蘭氏染色，應用光學顯微鏡對其形態(tài)進行顯微觀察，參照東秀珠等方法進行鑒定[9]。

1.2.4.2 生理生化特性

生理生化方法參考東秀珠等方法進行[9]。

1.2.4.3 分子生物學鑒定

應用16S rRNA序列對該菌株進行分子鑒定。用滅菌牙簽挑取單菌落放入PCR管中，加入10 μl滅菌超純水，充分震蕩混勻，熱裂解后作為擴增模板。應用細菌16S rRNA通用引物（27F：5＇- AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3＇，1 492R：5＇- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3＇）進行擴增。PCR擴增反應條件：94.0 ℃ 35 s，51.0 ℃ 40 s，72.0 ℃ 80 s，72.0 ℃ 10 min，35個循環(huán)。

取3 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠檢測。樣品送到華大基因測序，測序結果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析，并利用MEGA 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定菌株類別。

2 結果與分析

2.1 車前子內生細菌的分離

本研究對車前子植物內生細菌進行了分離，經過多次分離、純化后，共獲得20株車前子內生細菌。其中，從根部分離獲得7株內生細菌，莖稈3株、葉片3株、花莖1株、花序6株。

2.2 車前子內生細菌抑菌活性測定

2.2.1 內生細菌對病菌的抑制作用

內生細菌對4種病菌的抑制作用如表1所示。20株內生細菌中有5株菌株對蘋果腐爛病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌、草莓灰霉病菌均具有一定的抑制作用，其分別為R-6、A-1、A-2、L-2、S-1，在對峙培養(yǎng)中均能出現(xiàn)較為明顯的抑菌帶。其中R-6菌株的抑菌效果最突出，除了番茄早疫病菌外，對其他3種病原菌的抑菌帶寬度均在2 mm以上。

表1 內生細菌對4種病原菌的拮抗作用

注：拮抗帶寬度：＋表示0～0.5 mm，＋＋表示0.5～2.0 mm，＋＋＋表示≥2.0 mm

2.2.2 車前子內生細菌發(fā)酵液抑菌活性測定

5株內生細菌的發(fā)酵液對4種植物病原菌的抑菌活性如表2所示，其中R-6菌株發(fā)酵液的抑菌活性最強，對小麥赤霉病菌的抑制率達77.4%（圖1），對其他3種病原菌的抑制率均在60.0%以上。其余4株內生細菌的抑菌活性相對較差，其抑菌率均在60.0%以下。

表2 5株車前子內生細菌發(fā)酵液的抑菌作用 %

2.2.3 組織活體抑菌活性測定

從圖2可以看出，R-6菌株發(fā)酵液對草莓灰霉病均有一定的保護作用與治療作用，其保護作用達56.9%，而治療作用略低于保護作用，為50.5%，表明在組織活體上菌株R-6對草莓灰霉病也具有較好的防治效果。

2.2.4 盆栽試驗

R-6菌株發(fā)酵液對黃瓜白粉病的保護作用和治療作用如表3所示。R-6菌株發(fā)酵液對黃瓜白粉病也具有一定的保護和治療作用，且保護作用優(yōu)于治療作用，其保護和治療作用分別為49.0%和37.3%。

表3 R-6菌株發(fā)酵液對黃瓜白粉病的防治效果

2.3 內生細菌R-6菌株的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)學觀察及生理生化特性

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，R-6菌株的菌落形狀為圓形或橢圓形，顏色為乳白色，凸起，邊緣呈褶皺狀，在顯微鏡下觀察為桿狀，單個或成雙或短鏈狀排列。

通過對R-6菌株生理生化指標測定，鑒定結果如表4所示。參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的形態(tài)學特征與生理生化特征分別與菌株R-6進行比對，可以初步確定菌株R-6為芽孢桿菌（）。

表4 菌株R-6生理生化特征

注：“＋”為陽性，“-”為陰性

2.3.2 R-6菌株的分子生物學（16S rRNA）鑒定

應用細菌通用引物，對R-6菌株16S rRNA進行PCR擴增，擴增產物進行測序。經拼接后菌株R-6的16S rRNA長度為1 448 bp，通過NCBI中的BLAST軟件進行相似性比較，R-6菌株核苷酸序列和貝萊斯芽孢桿菌（）的相似度為99.85%。采用MEGA5.0軟件基于鄰接法構建16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可見，R-6菌株與貝萊斯芽孢桿菌（）同處一支，遺傳進化距離最近。綜合菌株形態(tài)特征、生理生化測試結果與16S rRNA序列分析，初步鑒定R-6菌株為貝萊斯芽孢桿菌。

3 討論與結論

本研究從藥用植物車前子植株中共分離獲得20株內生細菌，分別來自其根、莖、葉、花序等不同組織，表明內生細菌在車前子植株各個組織均有分布，其中根部數(shù)量最多。目前研究表明，植物內生細菌具有多樣性，不同的植物種類、氣候條件、地理環(huán)境的內生細菌組成都有較大差異，即使同一植物的不同組織、不同生長時期內生細菌也有一定的變化[10]。

通過抑菌活性測定，篩選到一株抑菌活性最高的內生細菌菌株，命名為R-6，經初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（），在離體和活體條件下對供試病菌均有較好的抑制作用。另外在試驗過程中觀察到，經R-6菌株發(fā)酵液處理的黃瓜幼苗株高、葉片大小及葉片濃綠程度明顯優(yōu)于對照，表明R-6菌株發(fā)酵液不僅對黃瓜白粉病具有一定的防治作用，還可能對黃瓜生長也具有促進作用，這和花生內生細菌的研究結果一致[5]。文獻報道貝萊斯芽孢桿菌能產生對番茄早疫和番茄灰霉病菌具有抑制作用的揮發(fā)性物質[11]，本研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌揮發(fā)物對番茄早疫病菌也有微弱的抑菌作用，但活性較弱，未在文中列出。

通過形態(tài)特征、生理生化特性及分子技術初步鑒定R-6菌株為貝萊斯芽孢桿菌（）。目前，在生產和應用中，芽孢桿菌中研究較多的主要是枯草芽孢桿菌（）、蠟樣芽孢桿菌（）、地衣芽孢桿菌（）及解淀粉芽孢桿（）[12]，而對貝萊斯芽孢桿菌（）的研究相對較少。本研究從車前子篩選鑒定的生防菌株R-6，為內生菌應用生物防治提供了優(yōu)質的菌株資源，但該菌株田間防病效果及防病機理等尚待進一步研究。

[1] 楊潤亞，馮培勇，李清.植物內生真菌農藥活性的研究進展[J].農藥，2006，45（7）：440-443.

[2] KLOEPPER J W，BEAUCHAMP C J.A review of issues related to measuring colonization of plant roots by bacteria[J].Canadian Journal of Microbiology，1992，38（12）：1219-1232.

[3] STIERLE A，STROBEL D，STIERLE D.Taxol and taxane production by, an endophytic fungus of[J].Science，1993，260（9）：214-216.

[4] 何玲敏，葉建仁.植物內生細菌及其生防作用研究進 展[J].南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2014，38（6）：153-159.

[5] CHEN L，SHI H，HENG J，etc.Antimicrobial，plant growth-promoting and genomic properties of the peanut endophyteLDO2[J].Microbiological Research，2019，218：41-48.

[6] DAS G，PATRA J K，BAEK K H.Antibacterial properties of endophytic bacteria isolated from a fern speciesL.against foodborne pathogenic bacteriaandO157：H7[J].Foodborne Pathogens & Disease.2017，14（1）：50-58.

[7] RAJENDRAN L，SAMIYAPPAN R，RAGUCHANDER T，et al.Endophytic bacteria mediate plant resistance against cotton bollworm[J].Journal of Plant Interactions，2007，2（1）：1-10.

[8] 方中達.植病研究方法[M].3版.北京：中國農業(yè)出版社，2007.

[9] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[10] 江明明.幾株優(yōu)良內生菌的分離及鑒定[D].南京：南京林業(yè)大學，2016.

[11] GAO Z，ZHANG B，LIU H，et al.Identification of endophyticZSY-1 strain and antifungal activity of its volatile compounds againstand[J].Biological Control，2017，105：27-39.

[12] 陳楠楠，秦平偉，尹珺伊.解淀粉芽孢桿菌抗菌機制研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志，2018，30（12）：1464-1467.

Isolation, identification and biocontrol effect of endophytic bacteria in medicinal plant

Yang Xuemei, Gou Panning, Zhang Yunxiang, Lu Xuelan, He Yanting, Tian XiaoweiCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In recent years, biocontrol of plant disease has been widely concerned in the world.In order to enrich the resources of antagonistic microorganisms against plant diseases, the Chinese herbal medicinewas used as experimental material to isolate the endophytic antagonistic bacteria, with,,，andused in this study.20 strains of endophytic bacteria were tested by confrontation method.The results showed that 5 strains of endophytic bacteria showed strong inhibitory effect on the tested pathogens, especially R-6 strains.The protective and therapeutic effects of fermentation products of R-6 on strawberry gray mold and cucumber powdery mildew were 56.9%, 50.5% and 49.0%, 37.3%, respectively.According to its morphological characteristics, physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA sequence, the R-6 strain may belong to.

; endophytic bacteria; isolation; identification; biocontrol effect

1008-5394（2021）03-0037-05

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.008

P641.131；S152.72

A

2020-06-28

天津市大學生創(chuàng)新訓練計劃項目（201810061040）

楊雪梅（1997—），女，學士，專業(yè)：植物保護。E-mail：631619477@qq.com。

田小衛(wèi)（1976—），男，副教授，博士，主要從事農藥學教學及研究工作。E-mail：tianxiaowei@tjau.edu.cn。

責任編輯：楊霞