崔博顯，趙留群，趙勝，楊建德,通信作者，劉燕霏，張大偉,通信作者

依賴SRP對(duì)大腸桿菌膜蛋白定位的研究

崔博顯1，趙留群2，趙勝1，楊建德1,通信作者，劉燕霏1，張大偉2,通信作者

（1.天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300392；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300380）

大腸桿菌中，信號(hào)肽識(shí)別顆粒（signal recognition particle，SRP）識(shí)別并綁定核糖體正在翻譯的信號(hào)肽，引導(dǎo)新生肽鏈到細(xì)胞膜上。根據(jù)靶向膜蛋白生物素?；恚狙芯坷肳estern blot方法，對(duì)構(gòu)建的HDB51菌株及野生型菌株MG1655進(jìn)行大腸桿菌膜蛋白定位研究。對(duì)比不同菌株中是否含有SRP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺失SRP的HDB51菌株中檢測(cè)到依賴SRP的底物蛋白FtsQ 的定位，缺失SRP 明顯影響了FtsQ的定位，SRP具有輔助膜蛋白定位的功能，從而為研究依賴SRP性大腸桿菌膜蛋白定位提供理論依據(jù)。

大腸桿菌；信號(hào)肽識(shí)別顆粒；膜蛋白定位；FtsQ

大腸埃希氏菌（簡(jiǎn)稱）通常也被稱為大腸桿菌，Escherich在1885年發(fā)現(xiàn)大腸桿菌，且一直把它當(dāng)作腸道中菌群的正常部分，所以大腸桿菌一開始被認(rèn)為是非致病菌。到20世紀(jì)中期，才發(fā)現(xiàn)一些特殊血清型的大腸桿菌在人類和動(dòng)物中都具有致病性，特別對(duì)于嬰兒和幼畜（禽類），可導(dǎo)致敗血癥或嚴(yán)重腹瀉。大腸桿菌是常見的原核生物之一，屬于革蘭氏陰性菌，其代謝活動(dòng)能夠有效抑制腸道內(nèi)分解蛋白質(zhì)的微生物生長(zhǎng)，從而減少蛋白質(zhì)分解后的產(chǎn)物對(duì)人體造成的危害。此外，大腸桿菌還可以合成維生素B和維生素K，以及含有殺菌功效的大腸桿菌素[1-3]。

信號(hào)肽識(shí)別顆粒（SRP）是普遍存在于真核和原核生物體中的蛋白質(zhì)-RNA（Ffh-4.5S RNA）復(fù)合體，可介導(dǎo)共翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜過程，也可引導(dǎo)翻譯中的肽鏈進(jìn)入膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)通道[4-6]。大腸桿菌中SRP途徑，主要識(shí)別內(nèi)膜蛋白，這些蛋白在大腸桿菌中行使多種功能，如共翻譯蛋離子、小分子及生物復(fù)合體的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的分裂及細(xì)胞代謝等[7]。在大腸桿菌中，SRP識(shí)別并綁定核糖體正在翻譯的信號(hào)肽。當(dāng)信號(hào)序列從核糖體多肽通道出口出現(xiàn)時(shí)，SRP立即通過疏水作用識(shí)別信號(hào)序列并結(jié)合，從而形成SRP核糖體復(fù)合物（RNC?SRP），保證翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)同步正確進(jìn)行。SRP是大腸桿菌生存所必需的，缺失SRP會(huì)對(duì)機(jī)體造成影響，引發(fā)一系列的生理應(yīng)激效應(yīng)，其中很重要的是依賴SRP底物的蛋白的錯(cuò)誤定位或定位 失敗[7-9]。

探討依賴SRP的底物蛋白一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。近來通過核糖體圖譜技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了依賴SRP的蛋白有87%是內(nèi)膜蛋白，6%是間質(zhì)/外膜蛋白，3%是細(xì)胞質(zhì)蛋白，4%是未知蛋白[10]。本研究根據(jù)靶向膜蛋白生物素酰原理利用Western blot，對(duì)大腸桿菌膜蛋白定位進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

試驗(yàn)菌株如MG1655、HDB51 （Ampr，Kanr，基因由阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)），檢測(cè)抗體及質(zhì)粒包括p15A1-birA、p15A2-birA、pJH29-FtsQ-Avi、pJH29-EspP-Avi均有中科院工生所提供。

1.2 主要試劑

試驗(yàn)試劑如質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，Thermo公司的DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶，Solarbio公司的氯霉素、卡那霉素、慶大霉素、IPTG誘導(dǎo)劑、阿拉伯糖、goldview染色劑、SSCS試劑、TBST緩沖液、TAE緩沖液、DAB顯色液和LB培養(yǎng)基均購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

具體方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。將構(gòu)建正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化分別轉(zhuǎn)入不同感受態(tài)菌株中，獲得含有p15A1-birA的兩株MG1655（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）和含有p15A2-birA的兩株HDB51（pJH29-FtsQ-Avi和pJH29-EspP-Avi）細(xì)菌。

1.4 蛋白定位的檢測(cè)

挑取單菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中，加入20 μg/mL的氯霉素。對(duì)于菌株HDB51，需要加入0.2%的阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，37℃，220 r/min過夜培養(yǎng)。以1∶100稀釋，加入到30 mL LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)。其中HDB51加入或不加0.2%的阿拉伯糖，構(gòu)建成含有SRP或缺乏SRP的菌株。

當(dāng)OD值為0.5～0.6時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。同時(shí)加入終濃度為100 μmol/L生物素。培養(yǎng)3 h后，收集菌體，取出 1 mL菌液進(jìn)行離心，7 000 r/min離心2 min，取上清 40 μL加入10 μL的5×loading buffer，然后用沸水煮20 min。

將獲得的樣品進(jìn)行Western blot檢測(cè)，轉(zhuǎn)印的纖維膜用TBST稀釋1∶200一抗溫育1～2 h。用 TBST 在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記Streptavidin室溫孵育1 h，用 TBST 在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。用DAB顯色試劑盒顯色，觀察到目的條帶。

試驗(yàn)中添加了不同濃度的IPTG（0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L）誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。

1.5 缺失SRP對(duì)膜蛋白定位的影響

試驗(yàn)采用大腸桿菌HDB51，此菌株的基因由阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)。在添加或不添加阿拉伯糖情況下，構(gòu)成含有或缺乏Ffh的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株。在0.1 mmol/L IPTG作用下檢測(cè)膜蛋白定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 膜蛋白定位檢測(cè)

本研究成功構(gòu)建了表達(dá)生物素連接酶BirA和融合有標(biāo)簽Avi-tag（15個(gè)氨基酸，GLNDIFEAQKIEWHE）的靶蛋白EspP的質(zhì)粒，且都在啟動(dòng)子Ptac作用下，由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。靶蛋白還融合有FLAG-tag作為內(nèi)參，同時(shí)將兩個(gè)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入野生菌MG1655。EspP是依賴SecA/B途徑的底物蛋白，其C端位于細(xì)胞質(zhì)，C端融合Avi-tag，可被生物素?；?，見圖1。在不表達(dá)生物素連接酶BirA時(shí)，以FLAG標(biāo)簽可以檢測(cè)到EspP蛋白的表達(dá)，但是沒有檢測(cè)到生物素酰化的EspP。

2.2 不同濃度 IPTG對(duì)FtsQ的生物素酰化的 影響

采用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)，蛋白FtsQ最終的表達(dá)量無明顯區(qū)別。但是，隨著IPTG濃度增加，F(xiàn)tsQ的生物素?；街鸩缴撸妶D2，說明FtsQ的定位水平逐步降低。因此推測(cè)，高濃度的IPTG使部分FTsQ蛋白在胞內(nèi)不能正確折疊，形成包涵體，從而在胞內(nèi)積累，不能正確定位到膜上，造成生物素?；缴?。試驗(yàn)中選取的IPTG最佳濃度為0.1 mmol/L，此時(shí)FtsQ蛋白剛好能全部定位到膜上，生物素?；綆缀鯙榱恪?/p>

2.3 缺失SRP對(duì)膜蛋白定位的影響

在添加或不添加阿拉伯糖情況下，構(gòu)成含有或缺乏的菌株，即含有SRP或缺乏SRP的菌株，生長(zhǎng)曲線如圖3所示，在不添加阿拉伯糖時(shí)，菌株的生長(zhǎng)受到明顯抑制，說明大腸桿菌缺乏，蛋白的SRP轉(zhuǎn)運(yùn)途徑有可能被阻斷，導(dǎo)致有些膜蛋白不能準(zhǔn)確定位，可能影響細(xì)胞的功能。

在野生型菌株MG1655及添加阿拉伯糖的HDB51菌株中，沒有檢測(cè)到生物素?；腇tsQ，而在不添加阿拉伯糖的菌株HDB51，即缺乏SRP的菌株中，檢測(cè)到了明顯的條帶，蛋白FtsQ定位水平約為60%，說明SRP的缺失導(dǎo)致FtsQ部分蛋白不能定位。作為對(duì)照的依賴SecA/B途徑的蛋白EspP，無論是在野生型還是在缺乏SRP的菌株中定位水平基本一致，都在50%左右，見圖4，說明SRP的缺失不會(huì)對(duì)非依賴SRP途徑的底物蛋白產(chǎn)生影響。

3 討論

基因融合系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于研究蛋白的分泌及膜蛋白的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，例如融合堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶及β-丙酰胺酶[11]。在這些研究中，采取的普遍策略是確定融合蛋白是否穿過細(xì)胞質(zhì) 膜[12]。這些方法雖能夠定性檢測(cè)肽鏈?zhǔn)欠翊┻^膜，但不能分辨膜突變體與野生型菌株的蛋白定位的速度變化，試驗(yàn)可選取可被生物素?；慕Y(jié)構(gòu)作為融合標(biāo)簽，來檢測(cè)這種微妙變化[10]。若融合蛋白在穿過內(nèi)膜之前，轉(zhuǎn)運(yùn)速度減慢，可以檢測(cè)到明顯的蛋白生物素?；?。通過構(gòu)建靈敏檢測(cè)膜蛋白定位的方法，探索SRP菌株的蛋白定位情況，已成為研究大腸桿菌中SRP功能的重要技術(shù)手段[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)添加過量的IPTG時(shí)，雖然蛋白總體表達(dá)量并無明顯區(qū)別，但蛋白的定位情況受到明顯影響，推測(cè)過量的IPTG可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，同時(shí)使蛋白非正確折疊，不具有活性，在胞內(nèi)積累，不能定位到膜上，影響試驗(yàn)結(jié)果。IPTG添加量在較低濃度時(shí)，膜蛋白FtsQ幾乎全部定 位[9]。在大腸桿菌中，SRP識(shí)別并綁定核糖體正在翻譯的信號(hào)肽，當(dāng)信號(hào)序列從核糖體多肽通道出口出現(xiàn)時(shí)，SRP立即通過疏水作用識(shí)別信號(hào)序列并結(jié)合，從而形成RNC?SRP復(fù)合物，保證翻譯轉(zhuǎn)運(yùn)同步的正確進(jìn)行。SRP是大腸桿菌生存所必需的，缺失SRP會(huì)對(duì)機(jī)體造成毒性，引發(fā)一系列的生理應(yīng)激效應(yīng)，其中很重要的是依賴SRP底物蛋白的定位錯(cuò)誤或失敗[14]。本研究利用構(gòu)建的膜蛋白定位方法，以FtsQ為模式蛋白，檢測(cè)出SRP具有輔助膜蛋白定位的功能，為研究此類依賴SRP膜蛋白定位提供參考依據(jù)。

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Localization ofmembrane proteins dependent on SRP

Cui Boxian1, Zhao Liuqun2, Zhao Sheng1, Yang Jiande1,CorrespondingAuthor, Liu Yanfei1, Zhang Dawei2,CorrespondingAuthor

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Science, Tianjin 300380, China）

In,signal recognition particle（SRP）recognizes and binds signal peptides being translated by ribosome to guide the new peptide chain to the cell membrane.In this experiment, localization ofmembrance protein in HDB51 and MG1655 was studied by Western blot based on biotinylation for membrane proteins targeting.By comparing the presence or absence of SRP in different, the substrate protein FtsQ that depended on SRP in the strainHDB51 was localized.The location of FtsQ was significantly affected without SRP.This verifies that SRP helps membrane protein localization.It can provide references for the study of localizingmembrane proteins dependent on SRP.

; signal recognition particle; membrane protein localization; FtsQ

1008-5394（2021）03-0061-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.013

Q816

A

2019-10-22

天津市自然科學(xué)基金（16JCYBJC23500）

崔博顯（1996—），男，本科在讀，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：sealmp5@qq.com。

楊建德（1969—），男，教授，博士，研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail：jiandeyang@126.com。

張大偉（1978—），男，研究員，博士，研究方向：微生物發(fā)酵。E-mail：zhang _dw@tib.cas.cn。

責(zé)任編輯：張愛婷