丁巧玲，劉舒月，孟澤，李建軍

犬源偽中間型葡萄球菌的分離鑒定及藥敏特性

丁巧玲，劉舒月，孟澤，李建軍通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300392）

天津某寵物醫(yī)院接診的一例患膿皮病的11歲金毛犬，采集其眼部、鼻部和皮膚分泌物，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。分離菌株TJ-1經(jīng)培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、血漿凝固酶試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)及16S rDNA 序列分析，結(jié)果表明，TJ-1能分解果糖、乳糖、蕈糖、蔗糖、甘露糖、麥芽糖等，甘露醇和硝酸鹽還原反應(yīng)等為陰性，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性；進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，測(cè)序獲得長(zhǎng)度約為1 500 bp，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示分離菌與聚為一支，最終確定TJ-1菌株為偽中間型葡萄球菌（）。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果顯示，TJ-1菌株對(duì)苯唑西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢氨芐、多西環(huán)素、頭孢唑啉、米諾環(huán)素、頭孢呋辛等藥物敏感，對(duì)新霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素以及氨芐西林等耐藥。

犬；偽中間型葡萄球菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

偽中間型葡萄球菌（）為犬膿皮病的主要致病菌[1]。該菌能引起犬、貓、貂、山羊等多種動(dòng)物感染發(fā)病，臨床主要表現(xiàn)為膿皮病、外耳道炎、傷口感染、尿路感染等[2-4]。在發(fā)病初期，及時(shí)治療可以控制病情發(fā)展。在發(fā)病的中后期，可能會(huì)引起其他的并發(fā)癥，對(duì)臨床治療帶來(lái)困難。有研究報(bào)道動(dòng)物源偽中間型葡萄球菌可以感染人[5]，表明偽中間型葡萄球菌對(duì)公共健康有一定威脅。本文中患膿皮病的病犬皮膚表面可見(jiàn)多部位大面積脫毛、紅疹、膿包，并伴有呼吸道感染，在其眼部和鼻部出現(xiàn)膿汁樣分泌物。取樣后對(duì)病原菌分離鑒定，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為臨床犬偽中間型葡萄球菌病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

患病犬為天津某寵物醫(yī)院接診的一例11歲齡患膿皮癥的雌性金毛尋回犬（Lucky）。2×PCR MixPCR預(yù)混體系、DNA Marker DL2000均購(gòu)自上海捷瑞生物工程；LB瓊脂、藥敏紙片、十六種葡萄球菌生化鑒定管均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；凍干兔血漿購(gòu)自上海華康科技開(kāi)發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床檢查

主要針對(duì)病犬的免疫情況和病史進(jìn)行問(wèn)診，檢查病犬的精神狀態(tài)、體溫、呼吸等。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色觀察

采取病犬眼部、鼻部、皮膚分泌物在無(wú)菌條件下在LB培養(yǎng)基采用劃線方式接種細(xì)菌，在37 ℃的條件下培育24 h。挑取優(yōu)勢(shì)單菌落接種純化培養(yǎng)，革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 生化特性檢查

無(wú)菌操作將分離菌株接種于16支不同營(yíng)養(yǎng)源的葡萄球菌細(xì)菌生化管，37 ℃條件下48 h后觀察結(jié)果。

玻片法：在潔凈的玻片中心滴入0.9%生理鹽水，挑取少量細(xì)菌，與生理鹽水混合，制成菌懸液。若十幾秒內(nèi)沒(méi)有自動(dòng)凝固現(xiàn)象發(fā)生，加入購(gòu)買的新鮮兔血漿1環(huán)，與菌懸液混合，觀察分離菌凝固酶現(xiàn)象。

試管法：用生理鹽水4倍稀釋新鮮兔血漿，吸取0.5 mL于潔凈試管中，加入0.5 mL待檢的菌懸液，混勻，放于37 ℃恒溫水浴鍋中，每30 min觀察一次，觀察24 h，凝固為陽(yáng)性[6]。

1.2.4 細(xì)菌16S rDNA基因的擴(kuò)增與測(cè)序

挑取5～6個(gè)分離純化后的單菌落于PE管底部，采用煮沸裂解法制備細(xì)菌基因組DNA模板。PCR擴(kuò)增體系為DNA模板5.0 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，上、下游通用引物各1.0 μL，0.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳20 min，用透射式紫外分析儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物送往上海生工公司測(cè)16S rDNA基因序列，將獲得的基因序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast相似性搜索，獲取與分離株16S rDNA序列最為相近的序列。采用DNAstar軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā) 育樹(shù)。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

采用 K－B 紙片法對(duì)分離菌株進(jìn)行抗生素藥物的敏感試驗(yàn)[7]。無(wú)菌操作下，將分離菌株均勻涂布于LB平板上，依次貼上藥敏紙片，37 ℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。細(xì)菌對(duì)藥物的敏感程度與抑菌圈直徑的大小成正比，可判斷細(xì)菌對(duì)各種藥片的敏感度。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床結(jié)果

犬體重30 kg，體溫39.4 ℃，體味大。犬呈腹式呼吸，右頸前大片皮膚濕疹，背部皮膚有膿包，可視粘膜蒼白，眼部有膿狀分泌物，流黃色鼻涕。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)與染色觀察

將分離純化的1株細(xì)菌命名為TJ-1，該菌株在LB培養(yǎng)基上形成圓形、濕潤(rùn)、不透明、邊緣整齊、表面隆起的光滑菌落。涂片染色為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，多無(wú)規(guī)則葡萄串樣排列（圖1）。

2.3 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，蔗糖、乳糖、覃糖、甘露糖、果糖、麥芽糖、N-乙酰葡胺為陽(yáng)性反應(yīng)；甘露醇、木糖醇、硝酸鹽還原等為陰性。該菌株的菌體形態(tài)和生理生化特性基本符合葡萄球菌的特征（表1）。

表1 菌株TJ-1的生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“ ＋ ”表示陽(yáng)性反應(yīng)，“ - ”表示陰性反應(yīng)

玻片法結(jié)果顯示未出現(xiàn)凝固現(xiàn)象。試管法結(jié)果顯示，血漿樣品在4 h內(nèi)不凝固，在21 h時(shí)發(fā)生凝固（圖2），分離菌株TJ-1凝集酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，且有致病性。

2.4 菌株16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育分析

以分離菌TJ-1基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增16S rDNA序列，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小約為1 500 bp的目的條帶（圖3）。通過(guò)Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行基因序列同源性比對(duì)，表明分離菌株TJ-1的16S rDNA基因序列與AJ780976.1模式菌株序列同源性為99%；從進(jìn)化樹(shù)上可見(jiàn)分離菌TJ-1與AJ780976.1-親緣關(guān)系最近，與D83369.1處于小分支上，親緣關(guān)系較近，HM484980.1處于較大分支上，關(guān)系較遠(yuǎn)。與FJ389206.1、X66100.1、L37603.1warneri、D83363.1、AB009935.1、L37599.1、D83366.1、AB009933.1、AF004220.1、AB009940.16個(gè)參考株，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

2.5 藥敏試驗(yàn)

TJ-1菌株對(duì)苯唑西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢氨芐、多西環(huán)素、頭孢唑啉、米諾環(huán)素、頭孢呋辛等藥物敏感，對(duì)新霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素以及氨芐西林等耐藥（表2）。

表2 菌株TJ-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

偽中間型葡萄球菌是一類重要的動(dòng)物性病原菌，自2005年國(guó)內(nèi)外相繼有從不同動(dòng)物分離的報(bào)道，該病在犬類的膿皮病中最常見(jiàn)[8]。本研究從病犬的背部皮膚膿包、眼部膿性分泌物和膿性鼻涕里分離到1株TJ-1致病菌，通過(guò)16S rDNA基因序列分析結(jié)合生化特性將TJ-1菌株鑒定為偽中間型葡萄球菌。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，TJ-1菌株對(duì)新霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、青霉素以及氨芐西林等耐藥，對(duì)苯唑西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢氨芐、多西環(huán)素、頭孢唑啉、米諾環(huán)素、頭孢呋辛等藥物敏感，這與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的偽中間型葡萄球菌的藥敏譜一致[9-12]，且該菌出現(xiàn)多重耐藥的情況。通過(guò)與馮言言等對(duì)膿皮癥分離菌的藥物敏感情況進(jìn)行對(duì)比[13]，頭孢類藥物對(duì)分離菌敏感性較高，可作為該病治療的首選藥物。

寵物源偽中間型葡萄球菌的報(bào)道逐年增多，主要可引起伴侶動(dòng)物（主要為犬、貓）的皮膚、軟組織及泌尿道感染等[8]。并且隨著偽中間型葡萄球菌的耐藥性不斷增加，尤其是耐甲氧西林偽中間型葡萄球菌的出現(xiàn)和流行，國(guó)外已有偽中間型葡萄球菌感染人的報(bào)道[14-15]，嚴(yán)重威脅公共健康。

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Isolation, identification and drug resistance of canine

Ding Qiaoling, Liu Shuyue, Meng Ze, Li JianjunCorrespondingAuthor

（Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

An 11-year-old golden-haired dog with pyoderma was admitted to a pet hospital in Tianjin.The secretions of eyes, nose and skin were collected for bacterial isolation and culture.The results of culture characteristics, staining microscopy, biochemical test, plasma coagulase test, drug susceptibility test and 16S rDNA sequence analysis showed that the isolate TJ-1 decomposed fructose, lactose, mushroom sugar, sucrose, mannose, maltose, mannitol and nitrate reduction were negative, while plasma coagulase test was positive.The 16S rDNA sequence was amplified by PCR and sequenced.The phylogenetic tree analysis showed that the isolate was clustered with Staphylococcus pseudintermedius and TJ-1 strain was identified as S.pseudintermedius.Drug susceptibility test showed that the bacteria were susceptible to oxacillin, ceftazidime, cefoperazone, cefalexin, doxycycline, cefazolin, minocycline, cefradine, cefuroxime and amikacin, but resistant to erythromycin, penicillin, ampicillin and carboxybenicillin.

dog;; isolation and identification; antibiotics sensitivity test

1008-5394（2021）03-0042-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.009

S852.61

A

2020-04-05

丁巧玲（1973—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)免疫學(xué)與動(dòng)物疾病學(xué)。E-mail：qiaolingding@126.com。

李建軍（1969—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)外科學(xué)與小動(dòng)物疾病學(xué)。E-mail：jianjunli2003@163.com。

責(zé)任編輯：張愛(ài)婷