陳良建 ，汪瑞芳，郭小平，李益民，何浩，李挺

(1. 中南大學(xué) 湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙，410013；

2. 中南大學(xué) 粉末冶金國家重點實驗室，湖南 長沙，410083)

種植義齒已逐漸成為修復(fù)牙缺失的主流技術(shù)?，F(xiàn)有的牙種植體多為全致密型，尚存如下不足：未提供骨組織長入的結(jié)構(gòu)條件，骨整合形成時間長(需 3～6月)，初期穩(wěn)定性低，種植體表面涂層易受植入剪切力破壞失效等。多孔種植體能提供骨質(zhì)長入種植體的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)生物固定，其力學(xué)性能與骨質(zhì)相匹配，是新型種植體的研究熱點。當(dāng)前鈦種植體改性研究多著力于改善種植體與細(xì)胞的親和力，促進(jìn)鈣磷沉積和新骨生成，缺乏種植體與周圍細(xì)胞和組織的深層互動。若新型鈦種植體能主動動員周圍細(xì)胞，啟動并強化成骨信號，加快種植體周圍骨組織的改建與整合，則有利于提高種植體初期的穩(wěn)定性和成功率。已有研究證實局部應(yīng)用生長因子可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，提高堿性磷酸酶活性和增加骨橋素mRNA的表達(dá)[1?2]。但生長因子直接局部應(yīng)用存在擴(kuò)散較快、易被蛋白酶分解、半衰期短等缺陷[3]。生長因子有效濃度和作用時間的維持是局部應(yīng)用的前提。本文作者用明膠微球作為生長因子的緩釋系統(tǒng)，通過體外細(xì)胞實驗研究載 TGF-β1緩釋明膠微球涂層的多孔鈦試樣對成骨細(xì)胞功的影響，并優(yōu)化明膠微球載TGF-β1作用濃度。

1 材料和方法

1.1 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦的制備

1.1.1 多孔鈦的制備

用粉末注射成形技術(shù)制備孔隙率為60%，孔徑為50～300 μm，呈連通孔結(jié)構(gòu)多孔鈦[4]。用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲波清洗各10 min。于溫度為60 ℃的烘干箱中干燥，高溫高壓消毒后備用。

1.1.2 載TGF-β1明膠微球的制備

用改良乳化冷凝聚合交聯(lián)法制備粒徑為 10～40 μm的明膠緩釋微球[1]。每1 mg干燥微球中分別加入0.5，5，50，500 mg/L 的 TGF-β1溶液各 5 μL，在 4 ℃，pH=7.4條件下，保持24 h，充分溶脹后離心(1 200～1 500 r/min)15 min, 雙蒸水洗滌2次，凍干，鈷-60照射滅菌封存。

1.1.3 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦的制備

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的明膠溶液浸泡多孔鈦，負(fù)壓條件下處理10 min，50 ℃干燥6 h。用無水乙醇配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/mL TGF-β1明膠微球懸液涂敷多孔鈦表面，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2.5%的戊二醛溶液浸泡試樣30 min后，用無水乙醇清洗3次，每次10 min，冷凍干燥，鈷-60照射滅菌封存。

1.2 細(xì)胞毒性實驗(MTT法)

將試樣按0.2 g/mL的比例浸泡于含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中浸提72 h后，收集浸提液于4 ℃保存。將L929細(xì)胞懸液按2.5×104個/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(200 μL/孔)，培養(yǎng)24 h。材料組取濃度分別為100%，50%和10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的浸提液交換原培養(yǎng)液，每組設(shè)6個平行孔。陰性對照組為含10%小牛血清的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基，陽性對照組加入10 μL濃度為8 mol/L的苯酚溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。加入噻唑藍(lán)(MTT)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入二甲基亞砜，振蕩，用酶聯(lián)免疫儀于波長490 nm下測其吸光度。

1.3 體外釋藥實驗

隨機選用載 TGF-β1濃度分別為0.025，0.25，2.5，25 mg/g明膠微球涂層多孔鈦試樣各3個，置于無菌24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入2 mL的1640培基，置于培養(yǎng)箱中24 h后，取浸提液后4 ℃保存，即為釋放24 h的待測浸提液。以同樣方法留取 2，4，6，8，10和12 d的浸提液于4 ℃保存。按TGF-β1ELISA試劑盒的操作說明，用酶聯(lián)免疫儀于450 nm波長下測定浸出液吸光度，與TGF-β1標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，計算各時間點樣本 TGF-β1濃度，繪制TGF-β1釋放曲線。

1.4 優(yōu)化明膠微球載TGF-β1濃度

用載不同濃度 TGF-β1明膠微球與 MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，通過檢測載 TGF-β1明膠微球?qū)?MG63細(xì)胞的增殖和分化影響，優(yōu)化其濃度。

1.4.1 細(xì)胞增殖檢測

用0.25%胰酶消化MG63細(xì)胞, 用含12%胎牛血清的1640培養(yǎng)基配制細(xì)胞濃度為5×104個/mL的細(xì)胞懸液。接種于24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，加配制的載TGF-β1濃度分別為0.025，0.250，2.500，25.000 mg/g明膠微球2 mg，對照組不加生長因子的微球2 mg，設(shè)3個復(fù)孔，分別培養(yǎng)3，7和14 d。按SunBioTMAm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑說明書操作，在波長490 nm下分光光度酶標(biāo)儀測定各孔有吸光度并記錄，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞增殖數(shù)。

1.4.2 細(xì)胞分化檢測

取置于離心管中第3，7，14 天的培養(yǎng)液, 按堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒說明書(南京建成生物工程工程所第一分所)進(jìn)行操作，用酶聯(lián)免疫儀測定各孔吸光度并記錄，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算ALP的活性。

1.5 載TGF-β1明膠微球涂層的多孔鈦試樣對MG63細(xì)胞的影響

1.5.1 細(xì)胞增殖的評價

設(shè)置3組實驗，實驗組為載2.5 mg/g TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦，對照組為直接用 100 μL 10 mg/L TGF-β1溶液滴至多孔鈦表面，未處理組為不加TGF-β1多孔鈦試樣，設(shè)3個復(fù)孔，以0.25%胰酶消化MG63細(xì)胞，以10%小牛血清的 1640培養(yǎng)基調(diào)整至濃度為4.0×104個/mL的懸液，取2 mL細(xì)胞懸液接種于放有3組試樣的24孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，分別在第3，7和14天，按SunBioTMAm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑說明書操作，在波長490 nm下分光光度酶標(biāo)儀測定各孔吸光度并記錄，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算細(xì)胞增殖數(shù)。

1.5.2 黏附形貌檢測

試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，分別在第7和第14天吸去培養(yǎng)液，再加入4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定，于4 ℃保存。用酒精梯度脫水，臨界點干燥，噴金，掃描電鏡檢測MG63細(xì)胞在多孔鈦表面的黏附形貌。

1.5.3 細(xì)胞分化評價

堿性磷酸酶(ALP)：試樣與 MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7，14 d后，收集各孔上清液，按ALP測定試劑盒說明書(南京建成生物工程工程所第一分所)進(jìn)行操作，用酶聯(lián)免疫儀測定各孔吸光度并記錄，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算ALP的活性。

骨鈣素(BGP)：試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d后，收集各孔上清液，按碘[125I]骨鈣素反射免疫分析藥盒(北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司)說明書進(jìn)行操作，用放射性檢測儀測定各孔放射性計數(shù)值并記錄，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算BGP活性。

1.6 統(tǒng)計分析

選用SpSS13.0統(tǒng)計軟件包，數(shù)據(jù)用平均值()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示(±s)，采用單因素方差分析，P＜0.05時，差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦表面形態(tài)

載TGF-β1明膠微球及其涂層多孔鈦SEM圖如圖1和2所示。可見：載TGF-β1明膠緩釋微球呈圓球型,粒徑較均勻，表面光滑，未見微孔和裂紋。多孔鈦的表面和孔隙壁上沉積了明膠微球涂層。

2.2 細(xì)胞毒性試驗

實驗細(xì)胞為 L929 細(xì)胞，3個實驗組分別為濃度100%，50%，10%的浸提液、陰性對照組和陽性對照組。復(fù)合培養(yǎng)3 d 后，采用MTT 法檢測試樣細(xì)胞毒性，用490 nm 酶聯(lián)免疫檢測儀測定吸光度，用吸光度計算相對增殖率(R)，R=De/Dn×100%。式中：De為試驗組的吸光度；Dn為陰性對照組的吸光度。按R進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(CTS)，見表1。由表1 看出，3 種濃度的浸提液的R值與陽性對照組比較差異均較顯著(p＜0.05)，CTS分級均為0～Ⅰ級，明膠緩釋微球涂層多孔鈦試樣無細(xì)胞毒性，符合《醫(yī)療器械生物學(xué)評價國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16886.1—2001》中對材料細(xì)胞毒性的要求。

圖1 載TGF-β1明膠微球SEM圖Fig.1 SEM image of TGF-β1 loaded gelatin microspheres

圖2 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦SEM圖Fig.2 SEM image of porous titanium coated with TGF-β1 loaded gelatin microspheres

表1 明膠微球涂層多孔鈦對L929細(xì)胞毒性結(jié)果Table 1 Results of cytotoxicity tests of porous titanium coated with TGF-β1 loaded gelatin microspheres with L929 cells

2.3 體外釋放實驗

生長因子的擴(kuò)散速度和載體材料的降解速度，明膠微球在堿性條件下完全降解約需 2月，體液pH=7.35～7.45，符合明膠微球降解的條件。用不加血清的細(xì)胞培養(yǎng)液為釋放介質(zhì)，按 TGF-β1ELISA試劑盒的操作說明。不同TGF-β1濃度的明膠緩釋微球涂層多孔鈦體外釋放曲線如圖3所示。從圖3可看出：初期釋放速度較快，24 h內(nèi)達(dá)到20%～30%，其釋放量與載TGF-β1的濃度相關(guān)，第3天時累計釋放量達(dá)40%；隨時間增加，釋放速度減緩，第8天時，4種濃度試樣釋放速率接近一致，第12天時累計釋放量為93%。

圖3 不同TGF-β1含量的明膠緩釋微球涂層多孔鈦體外釋放曲線Fig.3 Release profile of porous titanium coated with different concentration TGF-β1 loaded gelatin microspheres

2.4 載TGF-β1明膠微球作用濃度的優(yōu)化

2.4.1 TGF-β1濃度對細(xì)胞增殖影響

MG63細(xì)胞與載 TGF-β1明膠微球復(fù)合培養(yǎng) 3，7和14 d后，按SunBioTMAm-Blue細(xì)胞增殖與活性檢測試劑說明書操作。MG63細(xì)胞在不同濃度TGF-β1下培養(yǎng)3，7和14 d時增殖的比較如圖4所示。從圖4可看出：同一時間點不同濃度TGF-β1明膠微球?qū)G63細(xì)胞的增殖影響不同，TGF-β1濃度在0.025～0.25 mg/g范圍內(nèi)，TGF-β1的濃度與MG63細(xì)胞增殖呈劑量正效應(yīng)關(guān)系，當(dāng) TGF-β1濃度為 25 mg/g時，TGF-β1對MG63細(xì)胞增殖有抑制作用。

2.4.2 TGF-β1濃度對細(xì)胞分化影響

MG63細(xì)胞與載TGF-β1明膠微球復(fù)合培養(yǎng)3，7，14 d后，按ALP試劑盒操作。MG63細(xì)胞在不同濃度TGF-β1下培養(yǎng)3，7和14 d時ALP的活性如圖5所示。從圖5可看出：在0.025～2.5 mg/g范圍內(nèi)，TGF-β1濃度對 MG63細(xì)胞分化呈劑量正效應(yīng)關(guān)系，載 TGF-β1濃度為2.5 mg/g時，明膠微球?qū)G63細(xì)胞分化促進(jìn)作用優(yōu)于其他4組。

圖4 MG63細(xì)胞在不同含量TGF-β1下培養(yǎng)3，7，14 d時增殖的比較Fig.4 Comparison of cell proliferation of MG63 and different concentration of TGF-β1 after cultured 4, 7 and 14 d

圖5 MG63細(xì)胞在不同濃度TGF-β1下培養(yǎng)3，7和14 d時ALP的活性Fig.5 ALP activity of MG63 cells and different concentration of TGF-β1 after cultured 3, 7 and 14 d

2.5 載TGF-β1明膠微球涂層對成骨細(xì)胞功能的影響

2.5.1 細(xì)胞增殖

3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d，按SunBioTMAm-Blue試劑盒操作。3組多孔鈦試樣與MG63細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)合3，7和14 d后細(xì)胞增殖的比較如圖6所示?？梢姡涸谂囵B(yǎng)3和7 d時，實驗組成骨細(xì)胞數(shù)量最多，對照組其次，未處理組最少，第 14天時，實驗組高于其他2組，而對照組與未處理組細(xì)胞增殖數(shù)量差別無顯著性。

2.5.2 黏附形貌

圖6 3組多孔鈦試樣與MG63細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)合3，7和14 d后細(xì)胞增殖的比較Fig.6 Comparison of cell proliferation of MG63 and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)7和14 d后，掃描電鏡檢查 MG63細(xì)胞試樣表面黏附細(xì)胞數(shù)量與形貌。3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)7和14 d 的表面形貌如圖7所示?？梢姡? d時，實驗組試樣表面細(xì)胞數(shù)相對較多，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，偽足多，細(xì)胞附著在孔隙邊緣，有向孔隙內(nèi)遷移趨勢(圖7(a))；對照組試樣表面黏附的MG63細(xì)胞數(shù)量比實驗組少，細(xì)胞伸展良好，細(xì)胞跨過小孔隙形成細(xì)胞橋(圖7(c))；未處理組試樣表面黏附細(xì)胞比實驗組和對照組均少，細(xì)胞呈梭形，偽足少(圖7(e))。14 d時，3組試樣表面的細(xì)胞均生長良好，細(xì)胞多呈不規(guī)則多邊形，實驗組細(xì)胞偽足伸至微球表面，伸展良好，細(xì)胞緊貼孔隙側(cè)壁和底壁生長，細(xì)胞跨越孔隙連接成片，呈疊瓦狀結(jié)構(gòu)(圖7(b)；對照組試樣表面黏附細(xì)胞的形貌與實驗組相似，細(xì)胞跨越孔隙連接成片生長(圖 7(d))；未處理組細(xì)胞緊貼孔壁和孔底壁生長，但未形成疊瓦狀結(jié)構(gòu)(圖7(f))。從上述結(jié)果可看出，試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)7 d時，實驗組試樣表面黏附細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組和未處理組，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，偽足多；14 d時，實驗組和對照組試樣表面黏附細(xì)胞數(shù)量均明顯多于未處理組，細(xì)胞跨越孔隙生長連接成片，呈疊瓦狀結(jié)構(gòu)黏附在孔隙側(cè)壁和底壁，未處理組試樣表面黏附的細(xì)胞無此特點。

圖7 3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)7和14 d 的表面形貌Fig.7 Surface morphologies of MG63 cells cultured for 7 d and 14 d on three groups porous titanium samples

2.5.3 細(xì)胞分化

(1) ALP的檢測。3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d后，用ALP試劑盒檢測培養(yǎng)液中ALP活性。3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d后ALP的活性如圖8所示。從圖8可見：培養(yǎng)3和7 d時，實驗組與對照組中 ALP活性均高于未處理組的ALP活性，與未處理組比較差異有顯著性(P＜0.05)，而實驗組與對照組間比較差異無顯著性(P＞0.05)；14 d時，實驗組ALP活性高于對照組ALP活性，而對照組ALP活性高于未處理組ALP活性，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。

(2) 骨鈣素檢測。3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7，14 d后，用骨鈣素試劑盒檢測培養(yǎng)液中骨鈣素(BGP) 活性，結(jié)果如圖9所示。從圖9可見：培養(yǎng)3和7 d時，實驗組和對照組的BGP活性均高于未處理組的BGP活性，與未處理組的BGP活性比較差異有顯著性(P＜0.05)，而實驗組與對照組間差異無顯著性(P＞0.05)；14 d時，實驗組的BGP活性高于對照組BGP活性，對照組BGP活性高于未處理組BGP活性，組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。由上述ALP和BGP的檢測結(jié)果可知，多孔鈦試樣用TGF-β1處理后有利于MG63細(xì)胞的分化，載TGF-β1明膠微球涂層對MG63細(xì)胞的作用優(yōu)于直接用TGF-β1溶液組。

圖8 3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d后ALP的活性Fig.8 ALP activity of MG63 cells and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

圖9 3組試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)3，7和14 d后BGP活性Fig.9 BGP activity of MG63 cells and three groups porous titanium samples after cultured 3, 7 and 14 d

3 討論

鈦和鈦合金因具有良好力學(xué)性能和生物相容性，已被廣泛應(yīng)用于骨科的人工關(guān)節(jié)假體及牙種植體。鈦生物活性差，鈦植入體植入后形成骨整合時間一般需3～6 月。改善鈦種植體表面的生物活性，加快骨整合形成是新型種植體的研究熱點。局部應(yīng)用促骨組織形成的生長因子是種植體表面改性的策略之一。已有研究證實在骨替代材料表面吸附多種生長因子可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化、基質(zhì)分泌及鈣化，包括促進(jìn)有絲分裂因子(如IGF-1)，增強骨細(xì)胞活性的因子(如TGF-β1)和誘導(dǎo)成骨的因子(如BMPS 等)[1]。TGF-β1有促成骨和成軟骨作用，改變骨膜的細(xì)胞構(gòu)成，誘導(dǎo)礦化的骨形成[5?6]。外源性生長因子存在穩(wěn)定性低、生物膜透過性差、半衰期短、局部直接應(yīng)用在體內(nèi)很快被稀釋和分解等不足。藥物緩釋系統(tǒng)具有緩釋藥物、靶向輸送、在保證藥物治療作用的前提下減少給藥劑量、降低藥物毒性等優(yōu)點[7]。局部采用緩釋系統(tǒng)緩釋生長因子能解決上述不足，但選用的載體材料和合適生長因子作用濃度目前尚存爭議。適用于制備緩釋系統(tǒng)的材料有聚乳酸、明膠、殼聚糖等，聚乳酸在體內(nèi)降解產(chǎn)物為乳酸，可致局部發(fā)生炎癥反應(yīng)[8?9]。本研究選用明膠為緩釋材料，明膠的組織相容性好，能自然降解，降解產(chǎn)物不引起組織炎癥反應(yīng)[10]，是由氨基酸與肽類交聯(lián)形成的直鏈聚合物，能進(jìn)行多種表面修飾及反應(yīng)，且含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)生物活性短肽，可與細(xì)胞表面受體結(jié)合，有利于細(xì)胞表面黏附分子識別[11]；生長因子為多肽結(jié)構(gòu)，當(dāng)溶脹于明膠微球中，明膠能與多肽形成氫鍵，能穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象，從而保持生長因子活性，明膠微球被包裹藥物釋放速度相對緩慢，能達(dá)到緩釋的要求[12?13]。本課題組已采用改良乳化冷凝聚合交聯(lián)法優(yōu)化了明膠微球制備工藝[14]，本研究在此基礎(chǔ)上優(yōu)化明膠載 TGF-β1濃度，研究載 TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦試樣對成骨細(xì)胞的影響。

種植體植入骨內(nèi)10～12 d后，成骨細(xì)胞在種植體骨界面開始分化成骨，12～18 d成骨細(xì)胞活性增強，骨界面開始骨改建[15]。對種植體表面進(jìn)行生物化改性，促進(jìn)界面早期成骨細(xì)胞募集和分化，有利于骨整合形成。TGF-β1促進(jìn)已被募集來的成骨細(xì)胞合成Ⅰ型膠原、纖維結(jié)合蛋白，具有抑制破骨細(xì)胞的活化，刺激成骨母細(xì)胞的增殖和活化等作用[10,16]，呈劑量依賴性促進(jìn)骨源性間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨分化，TGF-β1濃度對軟骨細(xì)胞有促進(jìn)或降低分化的雙重調(diào)節(jié)作用[17]。在種植體表面用TGF-β1進(jìn)行表面改性，將有利于促進(jìn)早期啟動骨愈合程序，有利于骨整合形成，但目前局部應(yīng)用生長因子的最佳暴露時間和最佳濃度尚無定論。一般認(rèn)為低濃度TGF-β1促進(jìn)細(xì)胞增殖，而高濃度抑制細(xì)胞增殖[18]。有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1濃度在0.01～1.00 mg/L范圍內(nèi)，隨劑量增加對成骨細(xì)胞的增殖作用也增強，質(zhì)量濃度為1～10 mg/L時，促細(xì)胞增殖作用不明顯，質(zhì)量濃度大于10 mg/L時表現(xiàn)為對細(xì)胞增殖的抑制作用[19]，而也有研究認(rèn)為 TGF-β1在低濃度(小于 0.01 mg/L)時可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，大于0.01 mg/L時隨著濃度的增加，促增殖作用明顯減弱[4]。本研究體外實驗發(fā)現(xiàn)：載 TGF-β1明膠微球與 MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，TGF-β1濃度為0.025 mg/g的明膠微球?qū)G63細(xì)胞增殖無明顯作用，25 mg/g時對MG63細(xì)胞增殖有抑制作用，濃度在 0.25～2.5 mg/g范圍時，對 MG63細(xì)胞增殖和分化均有促進(jìn)作用，對細(xì)胞增殖呈劑量正效應(yīng)關(guān)系，TGF-β1濃度為2.5 mg/g的明膠微球?qū)?xì)胞增殖作用最優(yōu)。

材料表面形貌和粗糙度、表面化學(xué)組成、親水性、表面能和表面電荷影響細(xì)胞黏附。粗糙的表面結(jié)構(gòu)、良好的表面化學(xué)組成與親水性、高表面能和適合的表面電荷有利于成骨細(xì)胞的黏附[20?21]。本研究發(fā)現(xiàn)載TGF-β1明膠微球涂層和直接涂敷 TGF-β1的多孔鈦試樣與MG63細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)7和14 d后，試樣表面黏附的數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)、伸展?fàn)顩r均優(yōu)于未處理的多孔鈦試樣，培養(yǎng)7 d時，實驗組試樣表面黏附的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組。實驗組對MG63細(xì)胞黏附和增殖作用優(yōu)于B和未處理組，可能與以下因素有關(guān)：明膠是由氨基酸與肽類交聯(lián)形成的直鏈聚合物，含有能與細(xì)胞表面整合素受體結(jié)合的生物活性短肽(RGD)，有利于細(xì)胞表面黏附分子識別[11]，對細(xì)胞黏附有利；表層孔隙內(nèi)沉積載TGF-β1明膠微球，可持續(xù)釋放TGF-β1，能維持TGF-β1濃度相對穩(wěn)定，有利于細(xì)胞在試樣表面募集，促進(jìn)細(xì)胞合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞黏附提供條件。在3和7 d時，對照組試樣對MG63細(xì)胞的增殖和黏附作用優(yōu)于未處理的未處理組試樣，而14 d時，對照組試樣表面黏附細(xì)胞的數(shù)量和形貌均優(yōu)于未處理組，但對細(xì)胞的增殖作用兩組間差異無顯著性?？赡苁怯捎趯φ战M試樣的直接涂覆的 TGF-β1短時間內(nèi)大量稀釋到培養(yǎng)基，而TGF-β1半衰期短，易水解，維持有效作用濃度時間不長；TGF-β1促進(jìn)早期黏附的MG63合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)，為后期MG63細(xì)胞進(jìn)一步黏附提供基礎(chǔ)。

堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(BGP)是評價成骨細(xì)胞分化的指標(biāo)，ALP是成骨細(xì)胞早期分化的指標(biāo)，BGP是成骨細(xì)胞晚期分化指標(biāo)，主要在礦化形成期分泌。本研究發(fā)現(xiàn) TGF-β1局部應(yīng)用對 MG63細(xì)胞的分化有利，在3和7 d時，涂覆載TGF-β1明膠微球涂層的實驗組試樣和直接添加 TGF-β1液的對照組試樣培養(yǎng)液中ALP和BGP的活性均高于未處理組的ALP和BGP活性，在14 d時，實驗組培養(yǎng)液中ALP和BGP的活性高于對照組的ALP和BGP活性，對照組的ALP和BGP活性高于未處理組的ALP和BGP活性?？赡茉蚴牵憾嗫捉Y(jié)構(gòu)建立了細(xì)胞黏附的良好微環(huán)境，微球持續(xù)釋放有效濃度生長因子，高密度的細(xì)胞黏附可誘導(dǎo)快速的聚集和分化；細(xì)胞形態(tài)的改變也可促進(jìn)細(xì)胞分化[21]。從上述結(jié)果得知：載 TGF-β1明膠微球涂層對MG63細(xì)胞分化作用優(yōu)于直接涂覆TGF-β1的試樣。

4 結(jié)論

(1) 多孔鈦表層孔隙內(nèi)載TGF-β1明膠微球涂層具有緩釋作用，體外釋放持續(xù)時間約12 d，涂層無細(xì)胞毒性。

(2) TGF-β1濃度影響MG63細(xì)胞的功能，TGF-β1濃度為 0.25～2.5 mg/g范圍的明膠微球有利于 MG63細(xì)胞的增殖和分化，且呈劑量正效應(yīng)關(guān)系, 濃度為2.5 mg/g的TGP-β1作用效果最佳，濃度低于0.25 mg/g的效果不明顯，濃度高于2.5 mg/g時抑制增殖，但不影響分化。

(3) 載TGF-β1明膠微球涂層多孔鈦試樣對MG63細(xì)胞黏附、增殖和分化的作用優(yōu)于直接應(yīng)用 TGF-β1和未處理的試樣。載TGF-β1微球涂層試樣在3，7和14 d 3個時間段均能有效促進(jìn)MG63細(xì)胞的增殖和分化；直接涂覆TGF-β1溶液的試樣在3和7 d時有促進(jìn)細(xì)胞增殖作用，14 d時效果不明顯。

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