陳國培 賴心田 林霖 楊國武

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院 廣東深圳 518131)

1 前言

增城絲苗米、馬壩油粘米、盤錦大米等地理標(biāo)志大米具有良好的市場知名度和極高的市場價格，但是由于缺乏有效的真?zhèn)舞b定方法，導(dǎo)致一些不法企業(yè)或者假冒牌子，以假亂真，或者以次充好，大大地?fù)p害了地理標(biāo)志大米的市場信譽度和市場銷售。因此，建立起一套行之有效的鑒定體系，對于維持地理標(biāo)志大米產(chǎn)品的保護(hù)和市場秩序的維護(hù)非常必要。

廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)《DB44/303－2006馬壩油粘米》，以及國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T 23402－2008地理標(biāo)志產(chǎn)品 增城絲苗米》和《GB/T 18824－2008地理標(biāo)志產(chǎn)品盤錦大米》中對馬壩油粘米、增城絲苗米、盤錦大米的感官指標(biāo)(色澤、氣味、口感、組織形態(tài))以及加工質(zhì)量指標(biāo)、理化指標(biāo)進(jìn)行了規(guī)定，但是單從這些規(guī)定無法區(qū)分。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkiewicz等于1994年創(chuàng)建的一種分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是在SSR的3’或5’端錨定1－4個堿基作引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段序列進(jìn)行擴(kuò)增，而不是擴(kuò)增SSR本身。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子標(biāo)記的優(yōu)點，與SSR相比，ISSR不需要預(yù)先獲知序列信息而使成本降低，且多態(tài)性更豐富;與RAPD相比，ISSR重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，同時具備RAPD的簡便、易操作等特點;與RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本較低、DNA用量小、安全性較高。利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建DNA指紋圖譜已經(jīng)在植物分子生物學(xué)研究中得到廣泛的應(yīng)用。2009年歐力軍等從90個ISSR引物中篩選出條帶清晰、多態(tài)性高的引物37個，對水稻秈粳亞種進(jìn)行遺傳差異分析，通過UPGMA聚類分析法把秈稻和粳稻各劃為1支，并認(rèn)為ISSR分子標(biāo)記法適用于水稻秈粳性和廣親和基因的判斷;2010年范付華等為開展水稻新品種親緣關(guān)系的鑒定，拓展水稻種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用途徑，以篩選出的12條ISSR引物對23個水稻品種(系)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立了23份水稻品種(系)的ISSR指紋圖譜，經(jīng)聚類分析，可將所有材料嚴(yán)格地按粳、秈稻分為2類。

本研究采集了增城絲苗米7個品種、馬壩油粘米3個品種、盤錦大米5個品種，通過構(gòu)建ISSR分子標(biāo)記圖譜并進(jìn)行分析，為馬壩油粘米、增城絲苗米、盤錦大米的品種鑒別提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品

采集了增城絲苗米7個品種、馬壩油粘米3個品種、盤錦大米5個品種。采樣時優(yōu)先采集市場占有率高的優(yōu)勢品種，其中象芽香占和香絲苗A為近幾年增城市掛綠米業(yè)有限公司栽種的主要品種，美香粘和馬壩銀粘為馬壩油粘米在市面上的優(yōu)勢品種，盤錦大米樣品采集時涵蓋了近年來主推栽種的遼粳294、鹽豐47品種。其中6個增城絲苗米品種為增城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所的科研樣品，其余的增城絲苗米由增城市質(zhì)監(jiān)局及增城市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所協(xié)助采集并作現(xiàn)場鑒定，馬壩油粘米品種由韶關(guān)市曲江區(qū)質(zhì)監(jiān)局及曲江區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心協(xié)助采集并作現(xiàn)場鑒定，盤錦大米委托遼寧省盤錦市質(zhì)檢所采集和鑒定，樣品采集時均有農(nóng)藝專家現(xiàn)場鑒定以保證品種的純正性和純度。每個品種采集200g，于－20℃密封保存?zhèn)溆?見表1)。

表1 樣品采集資料

2.1.2 主要試劑

Taq酶和100bp DNA ladder Maker，均購自寶生物工程(大連)有限公司;ISSR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和β－巰基乙醇由Amersco分裝;瓊脂糖購自深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰尽?/p>

2.2 方法

2.2.1 DNA 提取

采用改良CTAB法，具體方法為:稱取0.5g大米樣品于2mL離心管中，加入1mL 65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液(臨用前加入2μLβ－疏基乙醇)，65℃水浴2h，加等體積氯仿與異戊醇(24∶1)混合液抽提，冰盒中振蕩10min，12000rpm離心10min，取出上清，再用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次，上清加入2/3體積的異丙醇，于－20℃沉淀DNA 2h，6000rpm離心6min收集沉淀，加入500μL 70%乙醇和100%乙醇洗滌，干燥后，用30μL TE緩沖液(含RNase 10μg/mL)溶解。用紫外分光光度檢測DNA樣品的濃度和純度，稀釋至50ng/μL作為PCR反應(yīng)的模板。

2.2.2 ISSR－PCR及瓊脂糖凝膠電泳

2.2.2.1 ISSR － PCR

ISSR －PCR 體系為:ddH2O，12.2μL;10 ×buffer，2μL;Mg2+(25mM)，1.5μL;ISSR 引物(10μM)，0.5μL;dNTP(2.5mM each)，1.6μL;Taq 酶(5U/μL，0.2μL;模板(50ng/μL)，2μL。

ISSR－PCR反應(yīng)程序為:94℃ 5min，94℃ 40s，53℃ 35s，72℃ 1min10s，72℃ 5min，循環(huán)數(shù)為 40。

2.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳

ISSR－PCR產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以100－2000bp DNA ladder為 Marker，100V 恒壓下電泳90min，凝膠成像系統(tǒng)照像。

2.2.2.3 ISSR － PCR

從增城絲苗米、馬壩油粘米、盤錦大米中各選取一個樣品提取DNA并以此為模板，對文獻(xiàn)中獲取的80個ISSR引物(見表2)進(jìn)行篩選，得出34個引物的擴(kuò)增效果較好。并用這34個引物對增城絲苗米7個品種、馬壩油粘米3個品種、盤錦大米5個品種提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每一個引物做兩次重復(fù)實驗，最后從34個引物的擴(kuò)增結(jié)果中選出條帶清晰，帶型穩(wěn)定的23個引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計，條帶統(tǒng)計時只統(tǒng)計帶型清晰且在兩次重復(fù)實驗中均出現(xiàn)的條帶。

表2 ISSR分析引物序列

2.2.3 數(shù)據(jù)分析

將瓊脂糖凝膠電泳圖中的不同樣品在相對于marker的不同位置上擴(kuò)增的產(chǎn)生的條帶進(jìn)行統(tǒng)計，有條帶出現(xiàn)的記為1，條帶不出現(xiàn)的見為0。用Excel 2003軟件計算3種地理標(biāo)志大米的多態(tài)位點數(shù)目、多態(tài)位點百分率和表型 Shannon指數(shù)。表型Shannon指數(shù)的計算公式為 H=－∑πi×lnπi，其中πi為條帶出現(xiàn)的比率。

對3種地理標(biāo)志產(chǎn)品進(jìn)行聚類分析，分析時使用Phyltools軟件(Version 1.32)對 ISSR數(shù)據(jù)構(gòu)建bootstrap 10000次重新抽樣的數(shù)據(jù)矩陣，并計算品種間的Matching距離，最后用Phylip軟件(Version 3.6.1)構(gòu)建 UPGMA 一致樹。

3 結(jié)果與分析

使用23個ISSR引物總共擴(kuò)增出216個條帶，多態(tài)性條帶為103個，單態(tài)性條帶為113個，多態(tài)位點數(shù)百分率為47.7%，其中增城絲苗米多態(tài)位點百分率為15.7%，馬壩油粘米多態(tài)位點百分率為10.2%，盤錦大米多態(tài)位點百分率為9.7%(見圖1)。表型Shannon指數(shù)所揭示的總遺傳多樣性為0.268，其中增城絲苗米為0.086，馬壩油粘米為0.065，盤錦大米為0.054。增城絲苗米、馬壩油粘米、盤錦大米的多態(tài)位點百分率和表型Shannon指數(shù)都較低，表明3種地理標(biāo)志大米產(chǎn)品品種內(nèi)差異不大。增城絲苗米、馬壩油粘米、盤錦大米的多態(tài)位點百分率和表型Shannon指數(shù)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于總體多態(tài)位點百分率和表型Shannon指數(shù)，表明遺傳差異主要體現(xiàn)在3種地理標(biāo)志大米產(chǎn)品品種之間。

圖1 引物823的ISSR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 基于Matching遺傳距離構(gòu)建的UPGMA樹

UPGMA聚類結(jié)果顯著支持盤錦大米自成一支，而增城絲苗米與馬壩油粘米構(gòu)成另一分支，支持率高達(dá)100%(見圖2)，并且體現(xiàn)出盤錦大米粳米與另兩種秈米在DNA水平上的顯著性差異。增城絲苗米與馬壩油粘米品種在聚類圖上區(qū)分為二個獨立分支，表現(xiàn)出兩種秈米仍存在一定程度的分化。

在3種地理標(biāo)志大米擴(kuò)增出的216個條帶中，期望尋找到每種地理標(biāo)志大米的特異性條帶，以便可以設(shè)計成特異性引物用于地理標(biāo)志產(chǎn)品的檢測。從結(jié)果看，216個條帶中存在著23個可區(qū)分盤錦大米與另兩種秈米的特異性條帶，其中9個條帶在兩種秈米10個品種所共有但在盤錦大米中無擴(kuò)增，有14個條帶在盤錦大米5個品種所共有但在另兩種秈米中無擴(kuò)增。此外，還有16個特異性條帶為個別品種所特有或為幾個品種所特有的條帶，但是沒發(fā)現(xiàn)增城絲苗米7個品種共有但在另兩種地理標(biāo)志大米中無擴(kuò)增的條帶，或是馬壩油粘米3個品種所共有但在另兩種地理標(biāo)志大米中無擴(kuò)增的條帶(圖1)。

4 討論

采集了3種受地理標(biāo)志保護(hù)的大米產(chǎn)品的稻谷品種，包括7個增城絲苗米品種、3個馬壩油粘米品種和5個盤錦大米品種，使用ISSR標(biāo)記法分析了大米的遺傳分化，由遺傳多樣性結(jié)果及聚類分析結(jié)果看，3種大米品種間差異較大，體現(xiàn)出一定程度的分化。

聚類分析結(jié)果表明每一種大米內(nèi)的遺傳變異程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于3種大米間的遺傳變異，這與樣品采集的情況相符。以增城絲苗米為例，其由增城本地野生稻品種經(jīng)過不斷的矮化改良培育而來，不同的品種之間有著或多或少的親緣關(guān)系。香絲苗2號、九七香、穗增香和香絲苗A四個品種親緣關(guān)系相近。香絲苗2號是使用增城高桿香占為母本，增城矮絲苗為父本培育而成。隨后，使用香絲苗2號、巴太早香、巴斯馬蒂為混合父本，青珍8號為母本，于1997年育成九七香;使用九七香、香絲苗2號為混合父本，增珍占3號或農(nóng)夫占為母本，于2001年育成穗珍香;使用九七香為父本，增珍占和農(nóng)夫占為混合母本，于2005年育成香絲苗A。因而這四種增城絲苗米品種在選育譜系中有明顯的關(guān)聯(lián)性，親緣關(guān)系相近。以馬壩油粘米為例，新銀粘是由馬壩銀粘培育而來的抗病性更強(qiáng)的品種，因而新銀粘與馬壩銀粘的親緣關(guān)系也相近。

3種大米的品種選育多是在本地原有品種的基礎(chǔ)上進(jìn)行培育，如增城絲苗米是由增城本地野生稻品種培育而來，馬壩油粘米采用的是在傳統(tǒng)馬壩油粘米基礎(chǔ)上培育而成。據(jù)考證，增城絲苗米、馬壩油粘米和盤錦大米的最早栽種時期170年、400多年和100多年的栽種歷史［7－9］，但考慮到本地種野生稻的長期進(jìn)化，增城絲苗米、馬壩油粘米和盤錦大米仍可能由于長期的地理隔離和進(jìn)化而體現(xiàn)出DNA水平上的差異，這與本實驗3種地理標(biāo)志產(chǎn)品間明顯的遺傳變異以及在UPGMA聚類分析上3種地理標(biāo)志產(chǎn)品各成一支的結(jié)果相一致。

然而，地理標(biāo)志大米在其品種的選育及栽種過程中，也會引進(jìn)外來品種進(jìn)行栽種或與本地品種雜交育種，以求獲得更高的產(chǎn)量、抗性和品質(zhì)。以增城絲苗米為例，象芽香占是由臺山引進(jìn)的新品種，由于其外觀較好、品質(zhì)較好、穩(wěn)產(chǎn)，因而在增城市晚稻栽種中廣泛使用。另一種增城絲苗米品種九七絲苗為2007年育成，培育過程中引進(jìn)了外地的占米作為親本培育。這樣情況的存在會對本實驗的結(jié)果產(chǎn)生影響，從UPGMA樹圖(圖2)上看出，九七絲苗與增城絲苗米的另6個品種的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而象芽香占與增城絲苗米的另4個品種有著明顯的差異，在聚類圖成各成一支?？紤]到這種情況，人為地去除九七絲苗與象芽香占的ISSR數(shù)據(jù)并重新進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明增城絲苗米與馬壩油粘米形成各自分支的支持率高達(dá)90%以上。這種結(jié)果暗示著企業(yè)在經(jīng)常性地引進(jìn)外來品種進(jìn)行栽種或與本地品種雜交育種時，會影響到本地品種的純種性能，是否會對本地稻谷品種品質(zhì)特性的保持產(chǎn)生不利的影響目前還不清楚。

本實驗使用23個ISSR引物共擴(kuò)增出216個條帶，依據(jù)216個條帶可完全區(qū)分實驗所分析的15個品種。參考 Ken＇ichi Ohtsubo 和 Sumiko Nakamura［10］和Kazunori Shinmura等［11］的方法，其均為在構(gòu)建分子標(biāo)記譜圖的基礎(chǔ)上篩選出可以用于鑒定不同大米品種的特異性DNA片段，再在此基礎(chǔ)上設(shè)計成特異性引物組合。因而，對ISSR引物所擴(kuò)增出的216個條帶進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，希望從中尋找3種地理標(biāo)志產(chǎn)品各自的特異性條帶。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盤錦大米與另兩種秈米存在這樣的特異性條帶，有9個條帶為兩種秈米共10個品種所共有但在盤錦大米中無擴(kuò)增，有14個條帶為盤錦大米5個品種所共有但在另兩種秈米中無擴(kuò)增。這23個特異性條帶應(yīng)為秈稻與粳稻分化的特異性DNA片段。但無法找到單獨一個條帶可以完全區(qū)分兩種秈米即增城絲苗米與馬壩油粘米，特異性條帶表現(xiàn)為增城絲苗米個別品種特異或是馬壩油粘米的個別品種特異，這樣的特異性條帶有16個，但是通過16個特異性條帶協(xié)同分析可以完全區(qū)分10個秈稻品種。

此次研究將ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到三種大米品種鑒定中，研究結(jié)果找到了盤錦大米區(qū)別于另兩種秈米的特異性條帶，并且找到了16個特異條帶可區(qū)別增城絲苗米與馬壩油粘米，但是用于區(qū)分增城絲苗米與馬壩油粘米的單獨特異條帶的查找卻還有待深入研究。

［1］ Zietkiew icz E，Ra falsk iA ，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20(2):176 － 183.

［2］ 樸紅梅，李萬良，穆楠等.ISSR標(biāo)記的研究與應(yīng)用［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，32(5):28－30.

［3］ 朱巖芳，祝水金，李永平等.ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用［J］.種子，2010，29(2):55－59.

［4］ 歐立軍，許棟，廖亞西.水稻秈粳亞種ISSR遺傳差異分析［J］.懷化學(xué)院學(xué)報，2009，28(11):22 －25.

［5］ 范付華，施文娟，阮仁超，等.23個水稻品種(系)的ISSR指紋圖譜及其親緣關(guān)系［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(9):5 －8.

［6］ Su Y J，Wang T，Yang WD，et al.DNA extraction and RAPD analysis of Podocarpus［J］.Acta Scientiarum Naturalium Universitis Sunyatseni1998，37:13－18.

［7］ 宋東海.利用野生稻培育絲苗米品種的研究［M］.廣州:廣東科技出版社，2007.

［8］ 商春艷，王宇.盤錦市優(yōu)質(zhì)水稻生產(chǎn)形勢與分析［J］.北方水稻，2007，3:38－40.

［9］ Ohtsubo K，Nakamura S.Cultivar Identification of Rice(Oryza sativa L.)by Polymerase Chain Reaction Method and Its Application to Processed Rice Products［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55:1501－1509.

［10］ Shinmura K，Kanagawa H，Mikami T，et al.Development of multiplex PCR primer sets for the identification of rice varieties［J］.Breeding Research，2005，7:87－94.