郝春慧 石長(zhǎng)華 郭寅生 劉紅艷 黃正

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院教育部環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖北武漢 430030;2.湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局)

1 前言

Microtox利用污染物毒性大小與細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度變化存在相關(guān)關(guān)系進(jìn)行急性毒性評(píng)價(jià)，應(yīng)用于環(huán)境污染物毒性檢測(cè)已有30年歷史，在對(duì)重金屬、簡(jiǎn)單有機(jī)污染物的毒性檢測(cè)中優(yōu)勢(shì)十分突出［1］，且已被我國(guó)(GB/T 15441－1995)和國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO11348－2007)列為急性毒性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法。

Microtox所采用的明亮發(fā)光桿菌為革蘭氏陰性，現(xiàn)有研究已表明革蘭氏陰性細(xì)菌因其外膜上脂多糖分子的存在導(dǎo)致其對(duì)疏水性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞具有屏障作用［2，3］，由于 Microtox 標(biāo)準(zhǔn)方法中受試物與細(xì)胞作用的時(shí)間只有15min［4］，受試物短時(shí)間充分進(jìn)入細(xì)胞受到脂多糖分子的屏障致使對(duì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜毒物檢測(cè)靈敏度呈現(xiàn)一定程度限制。但通過采用提高細(xì)胞通透性技術(shù)可望改善上述局限，目前國(guó)內(nèi)外還沒有這方面的報(bào)道。常見的用于增加細(xì)菌細(xì)胞通透性的物質(zhì)有:螯合劑(如EDTA)、多聚陽(yáng)離子(如多粘菌素B和慶大霉素)、大分子的有機(jī)一價(jià)陽(yáng)離子(如tris)及溶菌酶等。通過與細(xì)胞壁離子結(jié)合、去除肽聚糖結(jié)構(gòu)等方式提高細(xì)胞膜通透性［5］，比如 I.M.Helander和 T.Mattila－Sandholm 2000年用熒光探針NPN檢測(cè)EDTA及Na－HMP對(duì)綠膿桿菌、大腸桿菌及沙門氏菌細(xì)胞外膜上脂多糖的釋放來(lái)研究細(xì)胞通透性的改變，發(fā)現(xiàn)EDTA能引起細(xì)胞外膜高達(dá)40%脂多糖的釋放［2］。

檢測(cè)通透性改變的方法有以產(chǎn)色的頭孢硝噻吩為底物檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)β－內(nèi)酰胺酶的活性、用疏水熒光探針NPN檢測(cè)熒光強(qiáng)度、以放射性的14C標(biāo)記脂多糖(LPS)及電鏡下形態(tài)觀察［2］等。本研究采用EDTA去掉細(xì)菌外膜脂多糖、提高細(xì)胞通透性，用疏水熒光探針NPN(在含水環(huán)境中熒光微弱，而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)等非極性或疏水環(huán)境中熒光增強(qiáng)［2，3］)來(lái)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化，證實(shí)細(xì)胞通透性的改變。最終通過提高明亮發(fā)光桿菌通透性來(lái)改善Microtox檢測(cè)有機(jī)化合物毒性靈敏度，并采用高通量分析手段提高檢測(cè)效率。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 菌種

明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum T3變種)凍干粉，由中國(guó)科學(xué)院南京土壤所提供，－80℃超低溫冰箱保存。

2.1.2 主要儀器及試劑

Perkin Elmer－LS55型熒光分光光度計(jì);TECAN－F200型多功能酶標(biāo)儀;Fluotrac200 96孔板，;HQ－45B型恒溫?fù)u床;WH－2型微型漩渦混合儀;722型分光光度計(jì);IKA－KSBO型振蕩器;Eppendorf 5702 R型離心機(jī)。

N－苯基－1－萘胺(NPN，分析純):在棕色瓶中配溶解于丙酮(分析純)中的0.5mM NPN儲(chǔ)備液［3］，使用前用3%NaCl溶液稀釋;乙二胺四乙酸二鈉(EDTA－Na2，分析純)，200mM;支持緩沖液:NaCl 3%、Na2HPO40.5%、KH2PO40.1%、甘油0.3%，此緩沖液含 3%NaCl和 0.3%甘油，可以穩(wěn)定滲透壓和發(fā)光反應(yīng)時(shí)間，后面統(tǒng)稱其為lumis緩沖液;供試化合物1，10－二氮雜菲、1，4－對(duì)位苯醌、雙酚A(BPA)、4－異丙基苯酚均為分析純，測(cè)試前除1，10－二氮雜菲用3%NaCl溶解，其余均用助溶劑二甲亞砜(DMSO，分析純，購(gòu)自Sigma公司)配成一定濃度儲(chǔ)備液，然后分別取不同量溶解的有機(jī)物于3%NaCl溶液中配制成系列濃度測(cè)試液［6］。

2.2 方法

2.2.1 發(fā)光菌的培養(yǎng)

發(fā)光菌凍干粉用1mL3%NaCl復(fù)蘇，接入20mL液體培養(yǎng)基內(nèi)，25℃搖床培養(yǎng)12h(轉(zhuǎn)速約140r/min)，取10uL接入斜面培養(yǎng)基，經(jīng)25℃培養(yǎng)24h于暗室內(nèi)觀察可見明顯藍(lán)綠色發(fā)光后，放4℃冰箱備用。

2.2.2 菌懸液的準(zhǔn)備

將4℃保存的上述斜面菌種轉(zhuǎn)接到20mL液體培養(yǎng)基，25℃振蕩增菌至暗室內(nèi)觀察有明亮發(fā)光，轉(zhuǎn)移到15mL離心管，3000rpm 10min離心，收集菌體并用lumis緩沖液制成菌懸液，調(diào)整菌液濃度至722－分光光度計(jì)于600nm處測(cè)得此菌懸液A=0.4左右為止［6］。

2.2.3 EDTA處理及通透性改變的檢測(cè)

檢測(cè)體系中菌懸液、EDTA及NPN的體積比為2:1:1，用3%NaCl稀釋EDTA梯度系列的終濃度至10、20、30、40、50mM，NPN 的終濃度為10uM，陰性對(duì)照組中EDTA及NPN的比例用lumis緩沖液補(bǔ)足。用Perkin Elmer－LS55型熒光分光光度計(jì)檢測(cè)熒光強(qiáng)度，且每個(gè)系列做三個(gè)平行樣。根據(jù)NPN的特性設(shè)定檢測(cè)的激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)寬度300－500nm，狹縫寬度10nm。

NPN吸收系數(shù)=扣除陰性對(duì)照的菌液組熒光值/扣除陰性對(duì)照的緩沖液組熒光值。

2.2.4 EDTA對(duì)發(fā)光與菌數(shù)的影響

黑色96孔板為反應(yīng)板，按1:1的比例先后加入菌懸液和40mM的EDTA，每組三個(gè)平行，振蕩反應(yīng)15min后檢測(cè)發(fā)光。100uL菌懸液和100uL 80mM的EDTA混合涂布發(fā)光桿菌平板，以等量的菌懸液和lumis緩沖液為陰性對(duì)照，每組三個(gè)平行，25℃培養(yǎng)24h后菌落計(jì)數(shù)。

2.2.5 毒性檢測(cè)

用全黑平底96孔板，于1－6列的每孔中加60μL發(fā)光菌的菌懸液，多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光，并保證相同孔內(nèi)發(fā)光的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于5%，然后于1－3和4－6列的每孔分別加80uL的lumis緩沖液和100mM EDTA，并迅速于B－H行按照濃度梯度由低到高的順序每行順次加入60μL的標(biāo)準(zhǔn)毒物，IKA－KSBO型振蕩器25℃恒溫準(zhǔn)確振蕩15min，保證毒物與菌液充分結(jié)合，立即用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)發(fā)光，A行為陰性對(duì)照。

2.2.6 發(fā)光細(xì)菌半數(shù)發(fā)光抑制濃度 EC50的計(jì)算［4］

抑制率=1－(樣品發(fā)光平均值/對(duì)照發(fā)光平均值)×100%

利用線性回歸分析建立化合物濃度(C)與抑制率(T)%之間的相關(guān)方程，計(jì)算對(duì)應(yīng)發(fā)光抑制濃度EC50。

3 結(jié)果

3.1 通透性改變的檢測(cè)

各濃度的EDTA對(duì)熒光強(qiáng)度及發(fā)光細(xì)菌NPN吸收系數(shù)的影響見圖1及表1。從圖1及表1可見加入EDTA后，細(xì)菌對(duì)NPN的吸收系數(shù)明顯增加，其中濃度為40mM的EDTA對(duì)其影響最大，相對(duì)于不加EDTA的檢測(cè)系列，NPN吸收系數(shù)由8.8增加到13.0，最大增幅為47.7%，而過高濃度(50mM)的EDTA反而會(huì)抑制熒光物質(zhì)的吸收。

圖1 不同濃度EDTA對(duì)NPN熒光強(qiáng)度的影響

表1 EDTA濃度對(duì)發(fā)光細(xì)菌NPN吸收的影響

故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中均采用40mM EDTA處理明亮發(fā)光桿菌。

3.2 EDTA對(duì)發(fā)光與菌數(shù)的影響

40mM EDTA對(duì)菌體發(fā)光強(qiáng)度及菌落計(jì)數(shù)的影響示意圖見圖2，未加EDTA時(shí)每100uL A=0.4的菌懸液的發(fā)光強(qiáng)度及菌落計(jì)數(shù)的均數(shù)分別為8.3×105和6.34×106cfu/mL，加入 40mM EDTA 后分別為7.9×105和 6.35 ×106cfu/mL，經(jīng)配對(duì)設(shè)計(jì)的 t檢驗(yàn)，均有P＜0.05，因而40mM EDTA對(duì)菌體發(fā)光強(qiáng)度及菌落計(jì)數(shù)的影響均沒有顯著性差異。

圖2 40mM EDTA對(duì)菌體發(fā)光強(qiáng)度及菌落計(jì)數(shù)的影響

3.3 化合物對(duì)發(fā)光菌的毒性

實(shí)驗(yàn)所用4種供試化合物中，1，4－對(duì)位苯醌、雙酚A、4－異丙基苯酚均為水溶性極低的有機(jī)毒物。實(shí)驗(yàn)中采用DMSO作為非水溶性毒物的助溶劑，并以DMSO對(duì)發(fā)光菌生物毒性效應(yīng)的影響不超過1%所對(duì)應(yīng)的濃度作為實(shí)際操作中允許加入的界限濃度［6］。實(shí)驗(yàn)研究表明，在 DMS0濃度不超過10mM時(shí)，其對(duì)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度的抑制率不超過1%［6］，滿足毒性測(cè)定要求。

化合物對(duì)發(fā)光菌的抑制作用見圖3。從圖3可見化合物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制反應(yīng)的相關(guān)系數(shù)在加入EDTA前后均在0.99左右，其濃度與發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光抑制效應(yīng)呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。4種化合物急性毒性由大到小的順序是1，4－對(duì)位苯醌、4－異丙基苯酚、雙酚A、1，10－二氮雜菲，加入40mM EDTA作用15min后，毒物的EC50值分別有不同程度的降低，依次為 36.48%、30.29%、23.96%、23.94%(表2)，且毒性順序沒有改變。

圖3 加入EDTA前后各化合物對(duì)發(fā)光菌的劑量－效應(yīng)關(guān)系

表2 各化合物的EC50值(mg/L)

4 討論

早在1974年LORETTA LEIVE就曾做過利用EDTA來(lái)增加大腸類細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，使大分子藥物能更好的進(jìn)入細(xì)胞提高藥效的研究［7］，隨后開始廣泛應(yīng)用于臨床用藥研究［2，5］。本研究利用EDTA來(lái)改變明亮發(fā)光桿菌的通透性，效果顯著，用于Microtox，從而可以降低檢測(cè)限，提高檢測(cè)靈敏度。

本研究采用黑色96孔板［8，9］，每孔毒物和菌液的總量為200uL，整板的用量也不超過20mL，大大降低了檢測(cè)成本，可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)系列樣品，且便于多次平行測(cè)定從而提高準(zhǔn)確度［10］，而且全部96孔的掃描時(shí)間也不足2min。

由于日益嚴(yán)重的環(huán)境污染和治理評(píng)價(jià)工作的需要，導(dǎo)致目前生物毒性分析的待測(cè)樣本量大，傳統(tǒng)毒性檢測(cè)方法成本高、工作量大、耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法快速判定多種有毒化合物的相互影響。將改變細(xì)菌細(xì)胞的通透性及利用微孔板的高通量檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于污染物的微生物檢測(cè)，使微生物急性毒性試驗(yàn)更為快速、靈敏、高效、準(zhǔn)確，符合環(huán)境污染物毒性分析技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，在大范圍污染物篩查、優(yōu)先污染物篩選、聯(lián)合作用分析等方面有廣泛應(yīng)用前景。

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