王筱萌 祖元?jiǎng)?王 微 付玉杰 張 琳

(森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

傳統(tǒng)中藥用藥大多數(shù)為口服，藥物分子進(jìn)入血液循環(huán)、到達(dá)靶器官、達(dá)到藥效程度、產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，其中足夠量的藥物分子從胃腸道吸收是一個(gè)關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。因此，在口服創(chuàng)新藥物或者先導(dǎo)化合物、中藥有效成分和有毒成分研究過程中，其腸吸收研究顯得非常的重要［1－3］。目前，用于藥物吸收的實(shí)驗(yàn)方法包括體內(nèi)和體外兩部分。盡管體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫胤从辰o藥后藥物的吸收過程，但很難從細(xì)胞或分子水平研究藥物的吸收機(jī)制，而且由于動(dòng)物有個(gè)體差異，建立生物樣本中藥物的分析方法難度大。另外，整體動(dòng)物吸收代謝的耗藥量大，周期較長(zhǎng)，不適合藥物開發(fā)早期的快速篩選過程。而體外實(shí)驗(yàn)?zāi)芴峁┹^為直觀的藥物吸收過程的證據(jù)，因此被廣泛采用。目前，體外實(shí)驗(yàn)的方法主要有:在體腸灌流法、腸襻法、分離腸黏膜法、翻轉(zhuǎn)腸法等［4］。然而，這些方法存在著動(dòng)物組織與人體組織的差異性。從20世紀(jì)80年代起，國(guó)外開始應(yīng)用一種人結(jié)腸癌細(xì)胞(The Human Colon Carcinoma Cell Line，簡(jiǎn)稱Caco－2細(xì)胞)體外培養(yǎng)模型進(jìn)行藥物的吸收研究。Caco－2細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下自發(fā)形成上皮樣分化且可形成緊密連接，分化出絨毛面(apical side，AP端，頂端)和基底面(basolateral side，BL端，底端)，能夠表達(dá)刷狀緣酶、某些細(xì)胞色素藥物代謝酶和異構(gòu)酶，諸如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和磺基轉(zhuǎn)移酶等藥物代謝Ⅱ相酶。包括氨基酸、二肽、維生素、細(xì)胞抑制劑在內(nèi)的許多轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也在Caco－2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。Borchardt等［5］最早提出Caco－2細(xì)胞模型可用于研究藥物分子經(jīng)小腸上皮吸收的過程。Rubas等［6］比較了一系列具有低滲透率的藥物在Caco－2細(xì)胞模型和人體小腸的吸收，結(jié)果表明:細(xì)胞培養(yǎng)模型能很好地模擬腸道組織。因此，Caco－2模型被廣泛應(yīng)用于藥物研究與開發(fā)中，在藥物開發(fā)早期對(duì)藥物或者先導(dǎo)化合物的腸道吸收性質(zhì)所作出的科學(xué)評(píng)價(jià)，大大推動(dòng)了制藥業(yè)創(chuàng)新藥物開發(fā)的速度。在之前的研究中曾經(jīng)報(bào)道了小檗堿、喜樹堿、9－硝基喜樹堿、紫杉醇等［7－8］在 Caco－2 細(xì)胞單層模型的轉(zhuǎn)運(yùn)，預(yù)測(cè)其腸吸收，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Caco－2細(xì)胞單層的體外過程與藥物口服后在腸中的吸收和代謝有良好的相關(guān)性。

甘草次酸(Glycyrrhizic acid)是甘草的主要活性成分之一，具有抗過敏、抗炎、抗?jié)?、抗病毒和保肝、解毒等功效。由于甘草次酸有大多?shù)腎上腺皮質(zhì)激素的藥理作用，無其他嚴(yán)重不良反應(yīng)，被廣泛用于治療各種急慢性肝病。但長(zhǎng)期大量使用甘草次酸或甘草制劑，可引起浮腫、鈉水潴留［9］。甘草次酸在臨床中常被用于靜脈注射，口服給藥報(bào)道很少。本實(shí)驗(yàn)采用體外給藥的方法研究甘草酸的口服生物利用度。本文利用Caco－2單層模型對(duì)甘草次酸進(jìn)行體外轉(zhuǎn)運(yùn)的初步研究，預(yù)測(cè)甘草次酸在體內(nèi)的吸收機(jī)制，并且研究了P－糖蛋白抑制劑對(duì)甘草次酸吸收的影響。

1 材料與方法

Caco－2細(xì)胞，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù);甘草次酸(實(shí)驗(yàn)室自制)，MEM培養(yǎng)基(含谷氨酰胺、核糖核苷、脫氧核糖核苷，不含碳酸鈉，美國(guó)Hyclone公司)。

細(xì)胞培養(yǎng)［10－12］:將 Caco－2 細(xì)胞置于常規(guī)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，以MEM為培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1%非必需氨基酸，1%青霉素－鏈霉素雙抗液)，在溫度為37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2和相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換，4～5 d達(dá)到融合。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至覆蓋瓶底80% ～90%時(shí)，用含0.25%EDTA的胰酶消化，并以每1 mL 2.5×105個(gè)接種于Transwell聚碳酸酯膜六孔板中。在Transwell六孔板AP一側(cè)每孔加1.5 mL培養(yǎng)液，BL一側(cè)每孔加入2.5 mL培養(yǎng)液，第一個(gè)星期每天更換培養(yǎng)液，第8天只更換頂部培養(yǎng)液，8 d后每天更換頂部培養(yǎng)液，隔天更換底部培養(yǎng)液，至21 d。

跨膜電阻的測(cè)定:首先測(cè)量出沒有接種細(xì)胞之前聚碳酸脂膜的空白電阻，在計(jì)算接種細(xì)胞的TEER值時(shí)扣除空白電阻值。于接種細(xì)胞 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21 d 測(cè)定接種細(xì)胞的電阻值，當(dāng)細(xì)胞電阻值大于300 Ω·cm－2時(shí)，說明單層細(xì)胞膜趨于完整，可用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

甘草次酸雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn):配制甘草次酸母液濃度2000 μmol·L－1，將Transwell六孔板的上層培養(yǎng)液吸出，加入含有一定藥物濃度的HBSS 1.5 mL，下層加入不含藥物的HBSS 2.5 mL。①在0 h時(shí)按照?qǐng)D1加藥(從藥物母液中吸取，上層加藥)。在 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別于下層中取出緩沖液200 μL至2 mL離心管中，取藥后立刻補(bǔ)充相同體積的HBSS。3.0 h后更換新的HBSS緩沖液，重復(fù)3次。②在0 h時(shí)按照?qǐng)D2加藥(從藥物母液中吸取，下層加藥)。在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，分別于上層中取出緩沖液200 μL 至2 mL離心管中，取藥后立刻補(bǔ)充相同體積的HBSS。3.0 h后更換新的HBSS緩沖液，重復(fù)3次。

圖1 Transwell六孔板上層加入甘草次酸

圖2 Transwell六孔板下層加入甘草次酸

抑制劑對(duì)甘草次酸轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn):在Transwell六孔板AP側(cè)孔1、2、3 加入 11.25 μL 濃度為 15 μmol·L－1的甘草次酸，BL側(cè)孔 4、5、6 加入 18.75 μL 濃度為 15 μmol·L－1的甘草次酸。在BL側(cè)，如圖3方法加入抑制劑，其中A為25 μmol·L－1漢防己甲素，B為50 μmol·L－1維拉帕米。取樣方法及步驟同“甘草次酸雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)”。其中:孔1、2、3為AP→BL側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)，孔4、5、6 為 BL→AP 側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖3 加入抑制劑維拉帕米和漢防己甲素

HPLC－MS/MS 分析:色譜條件——色譜柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)為 Agilent Eclipse XDB－C18，流動(dòng)相為 V(甲醇)∶V(水)(含0.1%甲酸)=90 ∶10，流速為1 mL·min－1，柱溫為300℃，保留時(shí)間為8 min。

樣品處理:取200 μL樣品于2 mL離心管中，加入800 μL乙酸乙酯渦旋震蕩3 min;震蕩后3000 r·min－1離心5 min取上清液，移至新的2 mL離心管中;再向下層加入800 μL乙酸乙酯震蕩3 min，離心5 min取上清;混合2次上清液，氮?dú)猸h(huán)境揮干。殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，震蕩3 min;12000 r·min－1離心 5 min，取上清液。

數(shù)據(jù)處理:表觀滲透系數(shù)Papp代表藥物轉(zhuǎn)運(yùn)能力的大小。其公式為:Papp=(dQ/dt)/A×C0。式中:dQ/dt為接受藥物側(cè)待測(cè)藥物出現(xiàn)的速率，即滲透速率(單位為mmol·s－1);A為單細(xì)胞層表面積(4.2 cm2);C0為給藥測(cè)初始藥物濃度(單位為mmol·cm－3);Q(單位為mmol)為任何一點(diǎn)的累積轉(zhuǎn)運(yùn)量=被測(cè)樣品在接受側(cè)的量+先前所有時(shí)間點(diǎn)取樣總量。

外排率(EfR)=P(appBL→AP)/P(appAP→BL)，代表藥物凈外排能力的大小，同時(shí)也可以預(yù)測(cè)外排作用引起的藥物口服吸收減弱的程度。P(appBL→AP)為分泌表觀通透系數(shù)，P(appAP→BL)為吸收表觀通透系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Caco－2細(xì)胞完整性檢查結(jié)果

形態(tài)學(xué)檢查可觀察到完整的單層上皮細(xì)胞，細(xì)胞表面覆蓋一層刷狀緣絨毛，垂直于細(xì)胞表面，并且細(xì)胞具有不對(duì)稱性，細(xì)胞間連接緊密。這些形態(tài)均與小腸上皮細(xì)胞極為相似。TEER值＞500 Ω，細(xì)胞融合成連續(xù)的單細(xì)胞層。［1－3H］甘露醇放射性活度為1.25 ～1.37 Bq，可以認(rèn)為無甘露醇泄露［13］。結(jié)果表明:Caco－2細(xì)胞膜具有良好的完整性，可用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.2 甘草次酸濃度與轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)量的影響

應(yīng)用Caco－2細(xì)胞模型，對(duì)6個(gè)濃度(0.75、1.50、3.00、7.50、15.00、30.00 μmol·L－1)的甘草次酸分別考察了從 AP側(cè)→BL側(cè)和BL側(cè)→AP側(cè)的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)特征。在同一時(shí)間點(diǎn)，6個(gè)濃度的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨濃度和轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的變化而增大，并呈非線性飽和狀態(tài)(見圖4～圖6)。

圖4 甘草次酸(GA)隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的累積通透量(AP側(cè)→BL側(cè))

圖5 甘草次酸(GA)隨轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間的累積通透量(BL側(cè)→AP側(cè))

圖6 甘草次酸(GA)在Caco－2單細(xì)胞層中濃度和流量的關(guān)系

2.3 甘草次酸在Caco－2模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)

在Caco－2細(xì)胞模型中，藥物分子的滲透系數(shù)Papp與口服吸收相關(guān)聯(lián)，Papp的大小直接反應(yīng)了藥物經(jīng)腸道吸收的能力。吸收良好藥物的Papp大于10－6cm·s－1，吸收較好藥物的Papp為(0.1 ～1)×10－6cm·s－1，而吸收差的藥物的 Papp小于 10－7cm·s－1［14］。若在整個(gè)濃度范圍內(nèi)測(cè)得的 Papp值保持恒定，則認(rèn)為被動(dòng)擴(kuò)散為主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。Papp值可由AP→BL方向測(cè)得(Papp1)，也可由BL→AP方向測(cè)得(Papp2)。若Papp1與Papp2相同，也可認(rèn)為被動(dòng)擴(kuò)散為主要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制;若Papp2/Papp1＞1.5，則可能存在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［15］。

在甘草次酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，BL→AP側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù) Papp由(17.1±4.2)×10－6cm·s－1變化到(54.3±6.3)×10－6cm·s－1;而AP→BL側(cè)的轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù) Papp維持在(15.6±3.4)×10－6cm·s－1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:甘草次酸的Papp大于10－6cm·s－1。所以甘草次酸口服吸收良好，甘草次酸雙側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)流出率EfR=P(appBL→AP)/P(appAP→BL)=1.37＜1.5，則說明甘草次酸經(jīng)小腸上皮吸收主要為被動(dòng)擴(kuò)散。

2.4 抑制劑對(duì)甘草次酸轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)的影響

加入抑制劑維拉帕米后，甘草次酸從BL到AP側(cè)流出量由 16×10－6cm·s－1變化為 9.2×10－6cm·s－1，減少了 50% 左右;從 AP 到 BL 的流量從 12.9×10－6cm·s－1變化為 25.9×10－6cm·s－1，有約2.5 倍的增幅。在加入漢防己甲素后，甘草次酸從 BL 到 AP 側(cè)流出量由 16×10－6cm·s－1變化為 8.7×10－6cm·s－1，同樣減少了50%左右;從 AP到 BL的流量從12.9×10－6cm·s－1變化為 31.9×10－6cm·s－1，有約 2.8 倍的增幅(見表1)。結(jié)果表明:甘草次酸可能是細(xì)胞膜上P－糖蛋白的底物。細(xì)胞膜上的P－糖蛋白參與了甘草次酸的外排轉(zhuǎn)運(yùn)，維拉帕米和漢防己甲素有抑制細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)載體P－糖蛋白外排的功能。

表1 維拉帕米和漢防己甲素對(duì)甘草次酸在Caco－2 單細(xì)胞層中流量的影響 10－6cm·s－1

4 結(jié)論與討論

采用Caco－2細(xì)胞模型進(jìn)行藥物吸收機(jī)制研究是一種較好的模擬腸管真實(shí)的生理環(huán)境的離體實(shí)驗(yàn)，作為研究藥物吸收的快速篩選工具，能夠在細(xì)胞水平提供關(guān)于藥物分子通過小腸黏膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的信息，有重現(xiàn)性好、易于操作、可同時(shí)研究藥物對(duì)黏膜的毒性、與人體不存在種屬差異等優(yōu)點(diǎn)。但仍有不足，如藥物經(jīng)該模型的吸收與體內(nèi)實(shí)際吸收還有一定差距;細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng);該模型本身為純細(xì)胞系，缺乏在小腸上皮細(xì)胞中的黏液層，同時(shí)Caco－2細(xì)胞的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)較小腸上皮的低，因而在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的研究方面相對(duì)不如被動(dòng)擴(kuò)散藥物研究的成功。

本文探討了甘草次酸在Caco－2細(xì)胞模型上的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，結(jié)果表明:甘草次酸為吸收良好的化合物且主要為被動(dòng)擴(kuò)散;從P(appBL－AP)/P(appAP－BL)比值判斷，甘草次酸從BL端到AP端轉(zhuǎn)運(yùn)占優(yōu)勢(shì)。由此可推測(cè)出，在甘草次酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中可能存在外排機(jī)制。

P－糖蛋白是一種質(zhì)膜糖蛋白，是多藥耐藥基因mdr1的產(chǎn)物，存在于Caco－2細(xì)胞中，其功能是外排底物(或進(jìn)入BL端的藥物)。若甘草次酸是P－糖蛋白的底物，P－糖蛋白會(huì)將它們排到腸腔側(cè)(AP側(cè))［16］，使它們?cè)谛∧c中的吸收量減少。這也可能是說明甘草次酸從BL側(cè)到AP側(cè)的吸收較AP側(cè)到BL側(cè)吸收好的原因，有待于下一步實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究。

［1］楊秀偉，楊曉達(dá)，蒲小平，等.創(chuàng)新藥物研究中的吸收、分布、代謝、排泄/毒性(ADME/Tox)平臺(tái)建設(shè)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2004，36(1):5.

［2］楊秀偉.基于體內(nèi)過程的中藥有效成分和有效效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略［J］.中國(guó)中藥雜志，2007，32(5):365.

［3］楊秀偉.基于體內(nèi)過程的中藥毒性成分和毒性效應(yīng)物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)策略［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22(2):67.

［4］Gμpt A E，Vyas V，Ahmed F，et al.Pharmacokinetics of orally administered camptothecins［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，922:195－204.

［5］Hidalgo I J，Raub T J，Borchardt R T.Char acterizat ion of the human colon carcinoma cell line(Caco－2)as a model system for intestinal epithelial permeability［J］.Gastr Oent Erology，1989，96(3):736.

［6］Rub as W，Mlomwell M E，Sh ah rokh Z，et al.Flux measurements across Caco－2 monolayers may predict transport in human large intestinal tissue［J］.J Pharm Sci，1996，85:165.

［7］Maeng H J，Yoo H J，Kim I W，et al.P-glycoprot ein-mediated transport of berberine across Caco－2 cell monolayers［J］.J Pharm Sci，2002，91(12):2614－2621.

［8］Woo J S，Lee C H，Shin C K，et al.Enhanced oral biovailability of paclitaxel by coadminist ration of the P-glycoprotein in hibitor KP30031［J］.Pharm Res，2003，20(1):24－30.

［9］金敏，吳紅金.甘草次酸藥理作用的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2009，11(4):17－21.

［10］Liao X H，Wang J J，Gao M Y，et al.Effect of major components of Marijuana tablets on the transport of hydrochlorothiazide in Caco－2 cell monolayer model［J］.Acta Pharm Sin，2010，45:104－108.

［11］Cai R L，Wang M，Qi Y，et al.Selection and utilization on the evaluation criterions of Caco－2 cell model［J］.Chin Pharm J，2008，43:1471－1475.

［12］Sun M J，Sheng X，Hu Y Q.Establishment and validation of Caco－2 cell lines for intestinal epithelial permeability［J］.Chin Pharm J，2006，41:1431－1434.

［13］Cai W Q.Modern Useful Manual of Cell and Molecular Biology Techniques［M］.Beijing:People’s Military Medical Publisher，2003:22.

［14］Arturs son P，Karls son J.Correl at ion between oral drug absorption in humans and apparent drug permeability coefficients in human intestinal epithelial(Caco－2)cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1991，175(3):880－885.

［15］Rouquayrol M，Gaucher B，Roehe D.Transepithelial transport of prodrugs of the HIV Protease inhibitors saquinavir，indinavir and nelfinavir across Caco－2 cell monolayers［J］.Pharm Res，2002，19(11):1701－1712.

［16］Patel J，Bmddha B，Des S，et al.In vitro interaction of the HIV protease inhibitor ritonavir with herbal constituents:changes in P-gp and CYP3A4 activity［J］.Am J Ther，2004，11(4):262－277.