王金霞, 李愛芬, 周百成

（1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 暨南大學 水生生物研究中心, 廣東 廣州 510632;3. 中國科學院 研究生院, 北京 100039）

大型海藻無性系微球體構(gòu)建和反應(yīng)器培養(yǎng)研究

王金霞1,3, 李愛芬2, 周百成1

（1. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 暨南大學 水生生物研究中心, 廣東 廣州 510632;3. 中國科學院 研究生院, 北京 100039）

利用大型海藻細胞的全能性獲得了蜈蚣藻（Grateloupia filicina）、多管藻（Polysiphonia urceolata）和孔石莼（Ulva pertusaKjellm）的無性系材料, 在此基礎(chǔ)上分別構(gòu)建了絨球狀微球體、網(wǎng)狀微球體和簇生狀微球體 3種微球體形式, 這種微球體形式適合于大型海藻的生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)。簇生狀的孔石莼微球體在10 L藻類生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)密度達5.81 g/L 鮮質(zhì)量, 最高生長速度達到0.36 g/L/d 鮮質(zhì)量, 最大比生長速率為0.103/d。藻類生物反應(yīng)器高密度培養(yǎng)海藻無性系可用于海藻育苗、水產(chǎn)養(yǎng)殖水處理以及天然活性物質(zhì)生產(chǎn)等。

海藻無性系; 光生物反應(yīng)器; 微球體; 高密度培養(yǎng)

大型海藻生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)在海藻育種、育苗、天然產(chǎn)物和飼料生產(chǎn)以及水處理等方面有廣泛的應(yīng)用價值, 是藻類生物技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵下游技術(shù)[1]。由于在藻體形態(tài)構(gòu)建和生物反應(yīng)器選型方面都存在一定的問題, 所以大型海藻反應(yīng)工程研究落后于微藻方面的研究和應(yīng)用。

中國已經(jīng)建立了大規(guī)模的海帶、紫菜等海藻的育苗和養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)[2]。在此基礎(chǔ)上, 紫菜絲狀體（孢子體）懸浮培養(yǎng)技術(shù)已用于良種擴繁和育苗[3-4], 海帶、裙帶菜絲狀配子體懸浮培養(yǎng)已用于良種擴繁, 但采用高效生物反應(yīng)器進行培養(yǎng)僅處于初步試驗階段[5]。在國際上, 多數(shù)使用陸基水槽培養(yǎng)大型海藻葉狀體,試用于海藻生產(chǎn)或水處理等[6-7], 生物反應(yīng)器選型和高效培養(yǎng)的研究較少。

大型海藻具有比高等植物更強的細胞全能性,可以在無外加激素的條件下, 從各種外植體獲得可擴繁的無性系, 再通過無性系再生獲得葉狀體,成為一種新的育苗方法, 取代傳統(tǒng)的以孢子為起點的育苗技術(shù)[8-9]。在本項研究中, 以從切段、次生假根等外植體獲得的蜈蚣藻（Grateloupia filicina）、多管藻（Polysiphonia urceolata）和孔石莼（Ulva pertusaKjellm）無性系為起始材料, 進一步構(gòu)建停留在一定發(fā)育階段的微球體, 用氣升式光生物反應(yīng)器實現(xiàn)高密度培養(yǎng), 構(gòu)建了具有多種用途反應(yīng)工程模塊。

1 材料與方法

1.1 材料

3種海藻均采自青島太平角潮間帶, 在單藻培養(yǎng)條件下獲得無性系, 在實驗室條件下長期保存。蜈蚣藻是由果孢子萌發(fā)獲得的絲狀體, 多管藻是從藻體切段獲得的可以在室內(nèi)長年生長的藻體, 孔石莼是從葉狀體切塊再生獲得的無性系, 其次生假根可大量再生新的藻體[10]。

將無性系藻體切成 1～5 mm長的藻段, 于加 PES培養(yǎng)基[11]的海水中通氣培養(yǎng), 獲得小球狀藻落, 用于實驗。培養(yǎng)溫度約 15℃, 光照強度 30～40 μE/（m2?s）, 光暗周期為12 h: 12 h。培養(yǎng)液不加生長素和細胞分裂素。

1.2 培養(yǎng)

采用外照光、內(nèi)導流氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)海藻無性系。2種反應(yīng)器的體積分別為2 L和10 L。2 L反應(yīng)器用于海藻微球體構(gòu)建和擴培。

實驗用的10 L反應(yīng)器用有機玻璃制成, 包括具有環(huán)形支架的底座和加內(nèi)導流筒的反應(yīng)器（圖 1）。4支直徑25 cm, 32 W環(huán)形熒光燈置于環(huán)形支架上作為光源; 用時間控制器自動控制照光和通氣時間。反應(yīng)器主要技術(shù)參數(shù)如下: 高徑比2.78, 光徑9 cm, 受光面積（A）0.251 m2, 容積 12.5 L, 裝料體積（V）10.1 L,A/V為 23.68/m, 上升區(qū)與下降區(qū)體積之比為 0.41。反應(yīng)器表面入射光強可調(diào), 為66～112 μE/（m2s）。通氣量為0.3 m3/h, 設(shè)空氣過濾器。

圖1 氣升式藻類生物反應(yīng)器（10 L）Fig. 1 Airlift photobioreactor （10 L） for algae culture

培養(yǎng)液為海水加PES培養(yǎng)基[11]。用化學滅菌法對反應(yīng)器和培養(yǎng)液同時滅菌, 24 h后接種培養(yǎng)。光暗周期為12 h: 12 h, 24 h連續(xù)通氣培養(yǎng)。每天定時測量DO、pH和溫度。

1.3 生物量的測定

培養(yǎng)成球狀的藻體經(jīng)抽濾, 再用消毒海水沖洗 3遍, 繼續(xù)抽濾3～5 min。將藻體轉(zhuǎn)移到另一干燥濾紙上,進一步吸干藻體表面水分, 用電子天平稱鮮質(zhì)量。

比生長速率按下式計算:

其中,μ為比生長速率,Xt2、Xt1分別為t2和t1時的生物量。

1.4 其他

培養(yǎng)液的pH、溫度用上海雷磁儀器廠的pHS-3B型精密pH計測量。培養(yǎng)液的溶解氧量（DO）用上海雷磁儀器廠的 JPB-607型溶氧儀測量。光強用北師大光電儀器廠的FGH-1型光合有效輻射計測量。

2 結(jié)果

2.1 海藻無性系的構(gòu)建

蜈蚣藻是同型世代交替。生殖細胞附著后先形成盤狀體, 再長成直立株, 生活史中無絲狀體階段。但是, 通過培養(yǎng)可以從孢子、盤狀體和直立株外植體獲得絲狀體[9,12]。這種絲狀體的階段可以再生, 擴繁成單列細胞組成的絲狀體無性系（圖 2-1）。在靜止培養(yǎng)時, 切斷再生頂端細胞, 附著后在7 d以后開始形成盤狀體, 絲狀體不再伸長, 盤狀體繼續(xù)長大, 最后長出直立株, 進入正常的生活史循環(huán)。

多管藻也是同型世代交替。在自然界, 多管藻在冬季生長旺盛, 夏季消失, 其度夏機制并不清楚。但是, 如在生長期將藻體切段, 可以再生為植株, 并可在室溫條件下度夏[10]。這種藻體可以通過切段擴繁為長期保存的無性系。無性系藻體雖然也是由多列細胞組成, 具有中軸細胞和圍軸細胞等結(jié)構(gòu)特征,但是沒有野生藻體那樣的分枝結(jié)構(gòu)。雖然藻體表面的有些圍軸細胞會轉(zhuǎn)化為分生細胞, 長出無規(guī)則分枝, 但總體上呈絲狀形態(tài), 長度可達5 cm以上。此外, 還從圍軸細胞長出許多無色、透明的毛絲體（圖2-2）。藻體切段具有極性。一端再生為頂端細胞, 另一端產(chǎn)生絲狀假根。這些毛絲體和絲狀假根一旦同培養(yǎng)器皿的固體表面接觸, 就會迅速以二叉分枝的方式形成固著器, 成為獨立的完整藻體。

將孔石莼的葉狀體切割成小塊可以誘導獲得無性系[8]。在靜止培養(yǎng)條件下, 假根附著在基質(zhì)上, 從次生假根不斷長出新的絲狀藻體, 覆蓋瓶壁, 形成藻墊。將其取出, 剪碎成1～2 mm左右片段, 又能從次生假根生出新的藻體, 實現(xiàn)無性系擴增, 重新長成藻墊（圖2-3）。

2.2 海藻微球體的構(gòu)建

蜈蚣藻、多管藻和孔石莼的無性系在靜止培養(yǎng)時都形成固著器, 長成附壁的個體, 所以并不適于反應(yīng)器高密度培養(yǎng)。為此, 將這些海藻的無性系切段置于2 L氣升式反應(yīng)器中進行通氣、照光培養(yǎng)。在微重力和向光性的雙重作用下, 海藻切段經(jīng)過再生和擴繁, 形成適于反應(yīng)器培養(yǎng)的球狀藻落, 我們稱其為微球體（microsphere）。

蜈蚣藻由單列細胞絲狀體構(gòu)成絨球狀藻落。絲狀體呈輻射狀向外生長, 在懸浮培養(yǎng)條件下不形成 盤狀體, 繼續(xù)以絲狀體形態(tài)擴繁（圖3-1,3-2）。

圖2 3種海藻的絲狀體無性系Fig. 2 Filaments of three macroalgae

圖3 3種不同類型的海藻微球體Fig. 3 Three types of algal microspheres

多管藻無性系形成的微球體由多列細胞的假膜體構(gòu)成。線狀假膜體分枝交織成網(wǎng)狀。藻體上雖然也長毛絲體, 但在懸浮培養(yǎng)條件下失去附著機會,因此不形成固著器, 成為可懸浮的微球體（圖 3-3,3-4）。

孔石莼無性系的次生假根細胞具有全能性, 可以再生新的藻體, 在懸浮培養(yǎng)條件下形成球狀藻落。這種由次生假根再生的藻體最初是由單列細胞組成的絲狀體, 以后長成多列細胞的絲狀體, 少數(shù)可以長成二層細胞的小葉狀體。由于次生假根位于微球體中央, 藻體向外生長, 在懸浮培養(yǎng)時假根無法附著, 始終保持球狀生長（圖3-5, 3-6）。

根據(jù)其形態(tài)特點, 將蜈蚣藻的微球體稱為絨球狀微球體, 多管藻為網(wǎng)狀微球體, 孔石莼為簇生狀微球體。由于都具有再生能力, 可以將這些微球體剪碎培養(yǎng), 大量擴增為新的微球體。

2.3 海藻微球體的生物反應(yīng)器培養(yǎng)

在內(nèi)導流氣升式反應(yīng)器中, 向中央導流筒中的通氣管通空氣, 在導流筒中形成帶氣泡的上升流,海藻微球體被水流從反應(yīng)器底部帶入導流筒, 上升至頂部后再從導流筒回到外部由反應(yīng)器主體和導流筒間的環(huán)帶中, 在湍流條件下沉降, 同時接受光照,充分吸收 CO2和營養(yǎng)鹽, 然后再從底部進入中央導流筒。如此循環(huán)往復, 快速生長, 實現(xiàn)高密度培養(yǎng)。中央導流筒中通入空氣可以同時向培養(yǎng)液中補充CO2, 同時培養(yǎng)液沒有出現(xiàn) O2過飽和, 不會抑制海藻的光合作用。

首先用體積為 2 L的氣升式反應(yīng)器培養(yǎng)孔石莼無性系切段, 長成微球體, 鮮質(zhì)量為6.8 g。用消毒海水沖洗后將微球體置于10 L反應(yīng)器中通氣培養(yǎng), 起始密度為0.68 g/L鮮質(zhì)量, 初始溫度在室溫條件下, 培養(yǎng)過程中溫度和 pH均有所上升,最高溫度為26 ℃。每5 d測藻體鮮質(zhì)量, 同時以新鮮培養(yǎng)液更換1/10的培養(yǎng)液, pH保持在9以下。培養(yǎng)25 d后, 藻體生物量達到3.04 g/L鮮質(zhì)量, 為起始值的4.5倍。平均生長速率為0.094 g/（L?d）鮮質(zhì)量, 在第10 天達到最大比生長速率, 為0.092/d。孔石莼微球體的生長曲線和比生長速率變化見圖4。由圖4可見, 在 10 L反應(yīng)器表面入射光強為 112 μE/（m2·s）, 光周期10: 14 LD, 24 h連續(xù)通氣、通氣量為0.3 m3/h的培養(yǎng)條件下, 孔石莼微球體在25 d內(nèi)保持近似線性生長。

圖4 孔石莼在10 L藻類生物反應(yīng)器中的生長曲線Fig. 4 Growth curve forUlva pertusacultivated in 10 L airlift photobioreactor

在相同的培養(yǎng)條件下, 改變孔石莼微球體的接種密度, 獲得生長速率、比生長速率與接種密度的關(guān)系（表1）。結(jié)果表明當初始接種密度為1.40 g/L鮮質(zhì)量時, 用10 L反應(yīng)器培養(yǎng)孔石莼微球體可獲得最大生物量, 密度達到5.81 g/L鮮質(zhì)量的密度, 最高生長速度達到 0.36 g/L/d鮮質(zhì)量, 最大比生長速率為0.103/d, 經(jīng)過16 d培養(yǎng), 10 L反應(yīng)器中的總生物量已由14.0 g鮮質(zhì)量增加到58.1 g鮮質(zhì)量, 達4.15倍。

3 討論

傳統(tǒng)的大型海藻育苗都是以孢子為起始材料。如果利用海藻比高等植物更強的細胞全能性, 就可以利用各種外植體, 從營養(yǎng)體構(gòu)建無性系, 通過簡單的切段, 在不加激素的條件下大量擴繁、并形成新的植株, 用于育種和育苗。繼懸浮培養(yǎng)的紫菜絲狀體、海帶和裙帶菜等的絲狀配子體之后, 作者用3種海藻通過不同途徑獲得無性系, 再次證明了這種可能性。據(jù)報導, 一些具盤狀體的紅藻的切段也會產(chǎn)生可擴繁的絲狀體, 同樣可以建立無性系[13]。

表1 接種密度對孔石莼微球體光生物反應(yīng)器培養(yǎng)的影響Tab. 1 Effect of inoculation biomass density on growth rate for the microsphere ofUlva pertusacultivated in airlift photobioreactor

為了大規(guī)模培養(yǎng)海藻無性系, 需要構(gòu)建生物反應(yīng)器。Rorrer等[14]用不同類型的生物反應(yīng)器對 4種海藻的小球狀藻落進行培養(yǎng), 認為氣升式反應(yīng)器是最合適的類型。但是, 常用于微生物培養(yǎng)的這類反應(yīng)器結(jié)構(gòu)復雜, 不適應(yīng)于長時間無人值守運轉(zhuǎn)。我們已將通氣管改由頂部插入內(nèi)導流筒, 不會發(fā)生氧氣過飽和, 省略了止逆閥和脫氧裝置, 只需用時間控制器對通氣和光照時間進行控制, 反應(yīng)器就可以在無人值守下長期自動運作。氣升式反應(yīng)器可以充分利用空間, 減少占地面積, 在較小的恒溫室內(nèi)進行集約化控溫培養(yǎng)。氣升式反應(yīng)器易于放大, 作者已將反應(yīng)器放大到100 L, 可以用于規(guī)?；囵B(yǎng)。

海藻無性系切段在通氣培養(yǎng)條件下形成微球體,由于失去附著生長的條件, 所以停留在這一發(fā)育階段, 不斷擴繁和生長, 長期不進入生活史循環(huán)。因此,高密度培養(yǎng)海藻無性系的氣升式反應(yīng)器又可作為一種反應(yīng)工程模塊, 用于構(gòu)建水產(chǎn)養(yǎng)殖的水處理系統(tǒng)或生產(chǎn)餌料用海藻, 如孔石莼用于鮑魚室內(nèi)養(yǎng)殖。此外, 也可用于海藻天然產(chǎn)物生產(chǎn)。例如多管藻無性系常年高密度培養(yǎng)技術(shù)的建立為試劑級藻膽蛋白的生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。中國學者已對多管藻的各種藻膽蛋白作過晶體結(jié)構(gòu)解析[15], 而且已經(jīng)證明其所含的三峰型 R藻紅蛋白具有良好的穩(wěn)定性和熒光特性, 比國際市場上的雙峰型R藻紅蛋白的性能更為優(yōu)良。

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Received: Dec., 29, 2009

Key words:macroalgal clone; photobioreactor; microsphere; high-density cultivation

Abstract:Three macroalgal clones ofGrateloupia filicina,Polysiphonia urceolataandUlva pertusa, respectively,were obtained by the totipotency of marine algae. From them, three types of algal microspheres suitable for cultivation in a 10-L airlift photobioreactor were developed, which were flossy, netty and fascicular, respectively. The tufted microspheres ofU.pertusawere cultivated in the photobioreactor to the biomass density of 5.81 g/L FW L,with the maximum growth rate of 0.36 g/（L?d）FW and specific growth rate of 0.103 d?1. The technology of high-density culture of macroalgae in photobioreactor will have wide applications, including seeding, mass cultivation, integrate-aquaculture, and manufacture of bioactive products.

（本文編輯:譚雪靜）

Studies on developments of microspheres from macroalgal clones and cultivations in airlift photobioreactor

WANG Jin-xia1,3, LI Ai-fen2, ZHOU Bai-cheng1
（1. Institute of Oceanology, the Chinese Academy of Science, Qingdao 266071, China; 2. Jinan University,Research Center of Hydrobiology, Guangzhou, 510632, China; 3. The Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China）

Q813.1, S968.4

A

1000-3096（2011）02-0017-05

2009-12-29;

2010-12-17

廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點實驗室開放基金資助項目（JN2010-2）

王金霞（1975-）, 女, 山東青島市人, 博士, 主要從事藻類光合作用與生物技術(shù)方面研究, E-mail: jx_wang2003@126.com