劉國輝, 吳后波, 李 翔, 顏 文

海南島東部501站位沉積物古細(xì)菌多樣性研究

劉國輝1,4, 吳后波1, 李 翔1, 顏 文2,3

（1. 中國科學(xué)院 南海海洋研究所LMB實驗室, 廣東 廣州 510301; 2. 中國科學(xué)院 廣州天然氣水合物研究中心, 廣東 廣州 510070; 3. 中國科學(xué)院 邊緣海重點實驗室, 廣東 廣州 510301; 4. 中國科學(xué)院 研究生院,北京 100049）

從海南島東部501站位沉積物中擴(kuò)增古菌16S rRNA基因構(gòu)建文庫, 并對得到的OTU（Operation taxonomic units）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。古菌文庫由泉古生菌（Crenarchaeota）和廣古生菌（Euryarchaeota）構(gòu)成, 其中泉古生菌占總克隆文庫的 96.8%, 由Ⅰ型海洋泉古生菌（Mraine crenarchaeotic groupⅠ,MGⅠ, 74.6%）、GROUP A（14.9%）和GROUP B（7.2%）三簇組成。廣古生菌GROUP C簇占總克隆文庫的3.2%, 序列比對結(jié)果顯示它們與甲烷微菌綱（Methanomicrobial）中甲烷厭氧氧化菌（ANME）和甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）有較近的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系。研究表明海南島東南部近岸沉積物古菌多樣性比較豐富, 泉古生菌是該站位古菌的優(yōu)勢菌。

海洋沉積物; 16S rDNA; 古菌

海洋約占地球表面積的 71%, 絕大部分海底被海洋沉積物所覆蓋。隨著對海洋研究的深入, 人類逐漸意識到海洋在全球物質(zhì)循環(huán)和能量流動中的重要地位。海洋沉積物是海洋的最主要組成部分之一, 它是地球巖石圈和生物圈之間各元素生物地球化學(xué)循環(huán)過程的中樞。據(jù)估計, 海洋沉積物所蘊(yùn)含的生物量至少占到地球總生物量的1/10～1/3[1]。自從在海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)豐富的海洋古細(xì)菌[2], 人們在生物圈的多個生境發(fā)現(xiàn)古菌的蹤影, 促使人們改變以往的古菌只存在于極端環(huán)境的觀點, 古菌分布的廣泛性得到普遍的共識。由于古菌細(xì)胞外殼較細(xì)菌細(xì)胞更難于破解, 古菌細(xì)胞內(nèi)16S核糖體RNA基因拷貝數(shù)低于細(xì)菌等諸多因素影響[3], 通常導(dǎo)致對古菌定量分析造成較大偏差。最近, Julius[4]在全球海洋范圍內(nèi)的多個站位采集沉積物樣品, 以細(xì)胞膜磷脂類大分子為生物分子標(biāo)記物, 采用的定量 PCR和探針雜交為輔助手段, 證明古菌生物量占總沉積物原核生物量的絕大部分。

賦存于環(huán)境條件復(fù)雜的海底生境, 致使海洋古菌結(jié)構(gòu)和功能表現(xiàn)出復(fù)雜的多樣性。只有全面了解古菌的多樣性, 才能理解古菌在生命進(jìn)化過程的地位和各種元素生命地球化學(xué)循環(huán)過程中的作用。目前, 可以培養(yǎng)的古菌種類稀少, 非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法是研究古菌多樣性最主要的手段。原核生物16S rRNA基因所具有的特性, 使之成為系統(tǒng)發(fā)育分析天然的標(biāo)簽[5]。16S rRNA基因克隆文庫、熒光原位雜交（FISH）以及變性梯度凝膠電泳（DGGE）是目前研究微生物多樣性比較普遍的方法。FISH技術(shù)操作相對比較簡單高效, 其局限性是受數(shù)據(jù)庫已知序列影響比較大。16S rRNA基因克隆文庫和DGGE方法在 PCR的擴(kuò)增的過程中出現(xiàn)部分偏差, 但這并不影響它們作為研究環(huán)境微生物多樣性最重要的手段。

作者構(gòu)建海南島東南部近岸沉積物樣品的古菌16S rRNA基因文庫和系統(tǒng)發(fā)育樹來分析該樣品古菌的多樣性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 沉積物樣品的采集

2007年8月南海北部海洋觀測開放航次的抓斗取樣, 采自海南島東部近岸的501站位（18°59.995′N,110°41.835′E）, 水深 74 m, 沉積物為黑色的砂質(zhì)樣品, 采集后?20°C 保存。

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD）, DNA回收純化試劑盒（TAKARA）, 電泳儀（廣州正一）, 內(nèi)切酶（TAKARA）,凝膠成像儀（BIO-RAD）, PMD18-T（TAKARA）, 感受態(tài) DH5α（TAKARA）。

1.2 DNA的提取和純化

沉積物總DNA的提取, 在Zhou[6]的文獻(xiàn)提供的方法基礎(chǔ)上加以改進(jìn), 本文具體方法為: 取2 g沉積物樣品, 加入 6 mL DNA提取緩沖液[100 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）, 100 mmol/L Na2-EDTA（pH8.0）, 1.5 mol/L NaCl, 0.5% CTAB, 1% PVPP, 100 mmol/L Na3PO4和200 mg/L 蛋白酶K], 渦旋3 min后, 在搖床水浴振蕩30 min（37℃, 225 r/min）, 加入溶菌酶（終質(zhì)量濃度1 g/L）后振蕩30 min, 然后加入1 mL 20%SDS和該提取液體積 100 mg/L濃度的蛋白酶 K,經(jīng)60℃水浴300 min, 6 000g離心10 min, 將上清液移入新的離心管。沉淀重復(fù)抽提2次, 收集3次上清液于同一離心管中, 加入等體積的酚︰氯仿︰異戊醇（25︰24︰1）混勻, 9 000g離心25 min, 將上層水相移入新的離心管, 再加入等體積氯仿︰異戊醇（24︰1）, 9000g離心 25 min, 將上層水相移入新的離心管。加入0.6倍體積異丙醇, 于－20℃沉淀60 min。在4℃, 9 000g離心25 min, 棄上清, 沉淀用70%的乙醇洗兩次, 吹干。溶解于100 μL TE溶液。瓊脂糖電泳切膠回收, 試劑盒純化。

1.3 PCR擴(kuò)增

采用古菌通用引物 21F: 5′-TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3′和 958R: 5′-YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3′。50 μL PCR 反應(yīng)體系: 25 μL Extaq（Takara）,順反引物各 2 μL, 模板 1 μL, 用雙蒸水補(bǔ)足至 50μL。PCR 條件:3 min, 94 ℃ 30 s, 55℃ 45 s,72℃ 1 min, 25個循環(huán), 72℃ 延伸10 min。擴(kuò)增完畢后采用 Reconditioning PCR[7]: 取十分之一的 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物為模板, 用與上次PCR擴(kuò)增相同的反應(yīng)體系進(jìn)行3個循環(huán)擴(kuò)增。

1.4 16S rDNA文庫的構(gòu)建和RFLP分析

將 Reconditioning PCR得到的擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T-Vector, 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞里, 進(jìn)行藍(lán)白斑篩選, 通過菌落 PCR的方法篩選陽性克隆子。擴(kuò)增的插入片段分別用 HhaⅠ和 HinfⅠ這兩種內(nèi)切酶進(jìn)行完全酶切, 用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,分析兩種酶切后條帶的譜型, 對不同的譜型進(jìn)行分類統(tǒng)計并測序。

1.5 古菌16S rDNA序列分析

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA文庫分析

隨機(jī)挑取280個陽性克隆子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切,其中HhaⅠ酶切得到32個帶型, HinfⅠ酶切得到22個帶型, 對兩種酶切結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析后共得到 58個帶型。測序后經(jīng)在線嵌合體檢驗, 剔除嵌合體序列,對剩余的序列進(jìn)行Blast相似性比較, 把相似性大于97%歸于同一OTU, 最后得到221個有效克隆子, 分屬38個OTU, 這表明該站位沉積物中古菌多樣性是相當(dāng)豐富的。得到文庫的覆蓋率為 92.3%,該數(shù)值表明構(gòu)建的 16S rRNA基因文庫可以反映沉積物樣品的多樣性; 在線得到的稀釋曲線（圖 1）, 圖中隨著系統(tǒng)隨機(jī)取樣數(shù)增多, 曲線上升趨勢越來越緩慢, 顯示該 16S rRNA基因文庫基本能滿足樣品古菌多樣性分析的需要。

2.2 古菌16S rDNA文庫多樣性

16S rRNA基因文庫構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明: 沉積物中古菌被分為兩大類, 泉古生菌（Crenarchaeota）和廣古生菌（Euryarchaeota）, 其中泉古生菌含有 33個OTU, 占總克隆文庫數(shù)目的96.8%; 廣古菌含有5個OTU,僅占總克隆子數(shù)目的3.2%。泉古生菌主要分為 3簇, 主要為Ⅰ型海洋泉古生菌（Mraine crenar-chaeotic group Ⅰ , MG Ⅰ ）, 占 74.6%; GROUP A,占14.9%; GROUP B,占 7.2%（圖 2）。廣古生菌簇 GROUP C與甲烷微菌綱（Methanomicrobial）中甲烷厭氧氧化菌（ANME）和甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）有較近的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)關(guān)系（圖3）。

圖1 海南島東南部沉積物古菌16S rRNA基因rarefaction曲線Fig. 1 Rarefaction curve of archaeal 16S rRNA sequences from the sediment of southeastern Hainan island

Ⅰ型海洋泉古生菌共有 15個 OTU, 其中 8個OTU與來自印度的熱帶河口、珠江河口以及紅樹林沉積物的序列有很高的相似性（96%～99%）, 而且有6個OTU序列的相似性高達(dá)到99%, 這8個OTU共包含 147克隆子, 占總克隆文庫 66.5%, HND501-AC01序列與已完成全基因組測序海洋銨氧化古菌株（Nitrosopumilus maritimusSCM1）具有99%的相似性; 這一簇的另外7個OUT雖然僅占總克隆子文庫的 8.1%但是與它們相似序列分布范圍比較廣, 日本海洋熱泉微生物席淺層沉積物、北太平洋3 000 m深灰泥沉積物、維多利亞港西側(cè)沉積物, 韓國沿岸海域海綿組織共生菌。GROUP B簇中序列僅有HND501-AC67序列與來自印度洋Arabian海沿岸海水中序列有 98%的相似性, 其余的序列都與來自紅樹林沉積物、珠江河口、印度的熱帶河口的序列有90%～98%的相似性。GROUP B中所包含的序列信息表明這一簇明顯屬于海陸交界的一個類群, 這一簇中僅有的一個序列與沿岸海水中采集到的序列相似, 這可能是來自紅樹林或河口的泉古菌在沿岸海水中進(jìn)化適應(yīng)性的結(jié)果。與GROUP A簇有93%～99%相似性的序列的生境分布范圍非常廣泛, 分別來自印度的熱帶河口、鄂霍茨克海峽甲烷冷泉區(qū)、地中海泥火山口、北冰洋沉積物等。

GROUP C中HND501-AE76與來自印度洋中脊不活躍海底熱液煙囪的序列有 97%的相似性,HND501-AE60和HND501-AE14都與來自熱帶河口沉積物的序列有96%的相似性。HND501-AE40與來自甲烷冷泉沉積物的序列有 87%的相似性,HND501-AE39與來自海南紅樹林樣品中序列有98%的相似性。

3 討論

海洋沉積物, 特別是近海沉積物樣品中, 含有大量腐殖酸、褐菌素和重金屬離子等其他雜質(zhì), 這些雜質(zhì)極大地影響最終的分析結(jié)果, 為了最大化消除它們對后續(xù)實驗的影響, 采用 EDTA 有效絡(luò)合重金屬離子, 抑制核酸酶的活性, 并采用CTAB和PVPP有效地降低腐殖酸的濃度。在沉積物總DNA提取過程中先后兩次加入蛋白酶 K, 總質(zhì)量濃度為 300 mg/L, 溶菌酶和蛋白酶 K的使用大大提高了古菌的破膜效率, 提高了總DNA提取的數(shù)量。在PCR反應(yīng)進(jìn)入平臺期后, 引物的量急劇減少, 造成序列相近的模板之間退火幾率增加, 形成異源雙鏈。本實驗采用 Reconditioning PCR方法能有效地避免異源雙鏈結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。

Ⅰ型海洋泉古生菌是Delong首先發(fā)現(xiàn)于海洋環(huán)境中[2], 后來研究表明它廣泛分布于海水和海洋沉積物環(huán)境中。Ⅰ型海洋泉古生菌在海水中含量豐富,其多樣性化程度也非常高, 可能具有多樣的代謝類型。隸屬于Ⅰ型海洋泉古生菌海洋氨氧化古菌最近被分離純化[8], 這一類具有硝化作用的古菌, 廣泛分布于海水和沉積物上表面低氧和低氨的環(huán)境中, 在全球氮循環(huán)過程中具有關(guān)鍵的作用。從樣品中得到的序列與硝化古菌有較高的相似性, 說明該站位也存在氨的硝化過程。該站位得到的泉古菌序列占所得總古菌序列的絕大部分, 尤其是Ⅰ型海洋泉古生菌含量最為豐富, 可以推測泉古菌是該站位的優(yōu)勢古菌, 泉古菌可能在該站位的碳、氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)中占有十分重要的地位。

甲烷生成菌是一類嚴(yán)格厭氧, 能利用多種底物生成甲烷的古菌。甲烷氧化菌以甲烷為唯一的能源和碳源, 在減緩溫室效應(yīng)和全球碳循環(huán)過程中有重要作用。海洋沉積物釋放的甲烷主要被海底厭氧甲烷氧化古菌吸收。以往研究表明, 厭氧甲烷氧化菌主要有三個系統(tǒng)發(fā)育分枝（ANME-1、2、3）都是與產(chǎn)甲烷古菌有較近的同源關(guān)系, 在世界范圍多種沉積物環(huán)境采集到的樣品表明, 厭氧甲烷氧化菌大多與硫細(xì)菌共生[9]。甲烷生成菌已經(jīng)被純培養(yǎng), 它的甲烷生成分子機(jī)理已經(jīng)得到很好的闡釋, 海底厭氧甲烷氧化菌至今未得到純化, 所以對它的代謝機(jī)制還不是很清楚。在厭氧甲烷氧化菌中探測到甲烷生成菌最后一步關(guān)鍵酶甲基輔酶M還原酶A（McrA）的基因序列[10], 為厭氧甲烷氧化是甲烷生成的逆過程的假說提供了線索。我們在 HND501站位得到的序列屬于甲烷微菌綱, 從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出（圖3）,GROUP C的序列與ANME-1有更近的親緣關(guān)系, 暗示這些古菌可能與甲烷代謝相關(guān)。我們可以推測, 由于這個站位比較近岸, 陸地的有機(jī)物輸入與上層海水較高的生產(chǎn)力, 沉積物表層有機(jī)物含量非常豐富,表層 O2、NO3?、金屬氧化物依次作為電子受體被好氧細(xì)菌、硝化細(xì)菌等大量微生物很快消耗殆盡, 造成SO42?和CO2為電子受體的下表層具有很低的氧化還原電位, 這個環(huán)境為厭氧甲烷氧化和甲烷生成古菌生長創(chuàng)造有利的條件。

圖2 海南島東南部沉積物泉古菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of crenarchaeota 16S rRNA clones from the sediment of southeastern Hainan island

圖3 海南島東南部沉積物廣古菌16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of euryarchaeota 16S rRNA clones from the sediment of southeastern Hainan island

將該站位得到的古菌多樣性結(jié)果分別與我國南海范圍內(nèi)河口、紅樹林和深海沉積物古菌多樣性進(jìn)行橫向比較, 發(fā)現(xiàn)珠江河口淇澳島海岸帶沉積物[11]、海南島紅樹林土壤[12]與本站位得到的結(jié)果十分相似:泉生古菌是這些沉積物環(huán)境古菌中的優(yōu)勢菌, 這些序列本身相似性很高, 易成簇, 高度同源; 序列比對結(jié)果顯示, 地理相近或環(huán)境相似來源序列的相似性高, 這些序列數(shù)目也大多占優(yōu)勢; 廣古生菌只占很少一部分, 相關(guān)序列大多與甲烷代謝相關(guān)。南沙陸坡的深海沉積物[13]所得到泉古生菌和廣古生菌數(shù)量相當(dāng), 其中廣古生菌多樣性也比近海沉積物豐富, 泉古生菌和廣古生菌大多與深海生境得到的序列有很高的相似性。由此可以看出我國南海沉積物古菌多樣性和分布具有明顯的地理特色。

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Received:Jul., 26, 2010

Key words:marine subseafloor sediment; archaea

Abstract:Diversity of archaea was studied in marine sediment by PCR amplification and sequence analysis of 16S rRNA. Samples were from a site at the east of Hainan island. The phylogenetic analysis revealed that archaeal population was composed of Crenarchaeota and Euryarchaeota. Mraine crenarchaeotic group Ⅰ（74.6%）, GROUP A（14.9%） and GROUP B（7.2%） fall into Crenarchaeota. The GROUP C sequences were closely related to ANME and Methanosarcinales. The result indicates that archaea are diversified in surface environment of subseafloor sediment and Crenarchaeota is the predominant aechaea.

（本文編輯:梁德海）

Phylogenetic analysis of archaeal community from the sediment at location 501 at the east of Hainan island

LIU Guo-hui1,4, WU Hou-bo1, LI Xiang1, YAN Wen2,3
（1．South China Sea Institute of Oceanology, LMB, The Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301,China; 2. Guangzhou Center for Gas Hydrate Research, The Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510070, China; 3. Key Lab. of Marginal Sea Geology, South China Sea Institute and Guangzhou Institute of Geochemistry, The Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 4. Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Q938

A

1000-3096（2011）02-0086-06

2010-07-26;

2010-09-21

中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程重要方向項目（KZCX2-YW-211-03）; 中國科學(xué)院南海海洋研究所創(chuàng)新領(lǐng)域前沿項目（lyqy200312）

劉國輝（1982-）, 男, 山東煙臺人, 在讀碩士研究生, 主要從事海洋環(huán)境與分子微生物學(xué)研究, E-mail:wsw@scsio.ac.cn; 吳后波, 通信作者, 020-89023162, E-mail: wuhoubo@scsio.ac.cn