孟學(xué)平, 王 帥, 高如承, 申 欣, 程漢良, 田 美

（1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108）

西施舌群體遺傳結(jié)構(gòu)及分化的RAPD分析

孟學(xué)平1, 王 帥2, 高如承2, 申 欣1, 程漢良1, 田 美1

（1. 淮海工學(xué)院 海洋學(xué)院, 江蘇 連云港 222005; 2. 福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108）

采用55個隨機(jī)引物對西施舌（Coelomactra antiquata）5個群體, 即長樂（CL）、啟東（QD）、連云港（LYG）、膠南（JN）和北海（BH）群體進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增。用PopGen（Version1.32）軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果共篩選出12個重復(fù)性好的引物, 得到88條清晰穩(wěn)定的條帶, 擴(kuò)增片段在100 bp～3 000 bp之間, 其中引物S299擴(kuò)增的600 bp片段為長樂群體特有。多態(tài)位點比例為62.07%～78.26%（JN、LYG、BH、QD、CL群體分別為 78.26%、77.05%、72.58%、70.05%、62.07%）, Shannon指數(shù)為0.210 5～0.312 3。群體間遺傳距離為0.068 3～0.223 9, 其中長樂群體與其余4個群體間的遺傳距離為0.182 7～0.223 9, 4個非長樂群體的遺傳距離為0.068 3～0.136 7。群體間遺傳分化系數(shù)（Fst）為 0.313 01（P＜0.05）, 表明在整個遺傳變異中群體間占31.30%。CL群體與QD, BH, JN, LYG群體間的遺傳分化系數(shù)（Gst）分別為0.364 9,0.344 8, 0.325 0, 0.309 0; 而非長樂群體之間的遺傳分化系數(shù)為0.148 2～0.240 3; 以上數(shù)據(jù)顯示長樂群體遺傳分化最大。聚類結(jié)果顯示, 啟東和膠南群體首先聚為一支, 然后與北海群體聚在一起, 再和連云港群體相聚; 而長樂群體則單獨形成一支。

西施舌（Coelomactra antiquata）; 遺傳結(jié)構(gòu); RAPD

西施舌（Coelomactra antiquata）為淺海埋棲性雙殼貝類, 隸屬于軟體動物門（Mollusca）、雙殼綱（Bivalvia）、簾蛤目（Veneroida）、蛤蜊科（Mactridae）。西施舌自然分布于太平洋西部的日本、朝鮮、韓國及中國沿海和印度半島。我國南北沿海均有分布。西施舌營養(yǎng)價值高[1], 養(yǎng)殖前景看好。近10多年來,由于需求量的不斷增加, 各種掠奪性的捕撈和環(huán)境污染, 使西施舌產(chǎn)量逐年減少[2-3]。為了保護(hù)開發(fā)這種名貴貝類, 自20世紀(jì)60年代起, 國內(nèi)學(xué)者便開始對西施舌的生物學(xué)[4]、人工育苗[5]等進(jìn)行了研究。近年來, 群體遺傳差異研究報道日漸增多[6-10], 但全國西施舌總體遺傳關(guān)系尚不明朗。且目前報道的核苷酸多態(tài)性研究結(jié)果不能解析大多數(shù)群體間的差異。隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性 DNA（RAPD）分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的遺傳背景研究[11-13]。本研究用RAPD分子標(biāo)記分析我國 5個自然群體西施舌遺傳差異, 對存在的爭議作深入研究, 進(jìn)一步揭示西施舌群體間的遺傳差異, 為其遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定及其資源保護(hù)和利用提供核基因組DNA資料。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

實驗樣本于2004年10月至2007年5月分別采自山東膠南（JN）、江蘇連云港（LYG）、啟東（QD）、福建長樂（CL）、廣西北海（BH）5海區(qū)的野生西施舌。取閉殼肌浸于75%乙醇中, 4°C保存?zhèn)溆? 每個群體30個樣本。

DNA提取試劑、Taq酶（BBI）等 PCR試劑購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.2 DNA提取及濃度檢測

將酒精浸泡的西施舌閉殼肌（或斧足）, 洗滌除去乙醇吸干表面水分, 稱取50～100 mg, 剪碎, CTAB裂解液加蛋白酶 K裂解, 酚-氯仿抽提, 乙醇沉淀,TE緩沖液溶解。DNA經(jīng)電泳檢測, 用核酸蛋白檢測儀測定濃度后備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

實驗所用的 12個隨機(jī)引物從生工生物工程（上海）有限公司合成的55個引物中篩選得到, 引物編號及其序列見表1。

PCR 反應(yīng)總體積 25 μL, 其中含 10×Buffer2.5 μL,MgCl22.5 mmol/L, dNTP 0.2 mmol/L, 引物 0.5 μmol/L,Taq酶1.0 U, 50 ng模板。擴(kuò)增條件: 94 ℃預(yù)變性4 min,然后進(jìn)入PCR循環(huán), 即: 94 ℃變性45 s, 36 ℃退火45 s,72 ℃延伸1.5 min, 共進(jìn)行40個循環(huán)。最后72 ℃延伸8 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,GoldView染色, 凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

表1 隨機(jī)引物及其序列Tab. 1 RAPD primers and sequences

1.4 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果按照條帶的有無轉(zhuǎn)化為 1, 0距陣: 將電泳圖譜中每一條帶的遷移位置記作一個位點, 當(dāng)相同遷移位置的擴(kuò)增帶出現(xiàn)時記為1, 缺失記為0。將1、0譜帶矩陣輸入PopGen（Version1.32）[14]軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡定律檢驗（卡方檢驗）、計算群體多態(tài)位點率、Shannon信息指數(shù)、Gst等相關(guān)參數(shù)及進(jìn)行聚類分析。用Arlequin 3.1軟件進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

從供試的55個隨機(jī)引物中篩選出條帶清晰、穩(wěn)定、分布合理、重復(fù)性好、個體或群體特異性引物12個, 共擴(kuò)增出 88個條帶, 擴(kuò)增產(chǎn)物分子量為100～3000 bp。其中引物S299擴(kuò)增效果好, 能將長樂與其他群體分開。長樂群體多數(shù)個體有特征帶。部分RAPD圖譜見圖1。

2.2 遺傳多樣性分析

西施舌 5個群體的多態(tài)位點百分率在62.07%～78.26%之間, Shannon’S 信息指數(shù)Gst為0.2105～0.3123, 其中CL群體兩個多樣性指數(shù)最低,JN群體最高（表2）。

群體間的遺傳距離顯示（表 3）, 長樂群體與其余4個群體間的遺傳距離為0.182 7～ 0.223 9, 遺傳相似度為0.799 4～0.833 0; 而非長樂的4個群體的遺傳距離為0.068 3～0.136 7, 遺傳相似度為0.872 2～0.934 0。這表明長樂群體和其他群體的親緣關(guān)系相對遠(yuǎn)。

圖1 引物S299對西施舌不同地理群體的RAPD擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR results of five stocks ofCoelomactra antiquatausing primer S299

AMOVA 分析結(jié)果（表 4）顯示: 群體間遺傳分化系數(shù)Fst=0.313 01（P＜0.05）, 表明在整個遺傳變異中群體間占 31.30%, 遺傳分化大部分來自群體內(nèi)。由表5可知, CL群體與QD, BH, JN, LYG群體間的遺傳分化值分別為0.364 9, 0.344 8, 0.325 0,0.309 0; 而QD, BH, JN, LYG 4個群體之間的Gst值為 0.148 2～0.240 3; 以上數(shù)據(jù)顯示長樂群體和其他群體間的遺傳分化最大, 群體間的基因流（Nm）同樣呈這一趨勢。

表2 西施舌群體遺傳多樣性Tab. 2 Genetic diversity ofC. antiquata

2.3 聚類分析

用 Popgen（Version1.3.1）軟件構(gòu)建 5個西施舌群體的UPMGA系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖2可見啟東和膠南群體首先聚為一支, 然后與北海群體聚在一起, 再和連云港群體相聚; 而長樂群體則單獨形成一支。聚類結(jié)果顯示北部灣（BH）群體與黃海（QD、JN、LYG）群體親緣關(guān)系近, 與東海群體（CL）親緣關(guān)系遠(yuǎn), 其演化關(guān)系不規(guī)律。

表3 西施舌群體間遺傳距離（下三角）及遺傳相似性指數(shù)（上三角）Tab. 3 Genetic distances and identities ofCoelomactra atiquatastocks

表4 群體間分子變異分析Tab. 4 Analysis of molecular variance （AMOVA） among stocks

圖2 基于RAPD的西施舌5個地理群體的UPGMA分子系統(tǒng)樹Fig. 2 The UPMGA phylogenetic tree of five stocks ofCoelomactra antiquatabased on RAPD marker

3 討論

本研究顯示西施舌 5個自然群體多態(tài)位點比例（62.07%～78.26%）和香農(nóng)信息指數(shù)（0.210 5～0.312 3）都比較高, 說明西施舌遺傳多樣性較高。5個自然群體間遺傳距離為0.068 3～0.223 9。其中長樂群體與其余4個群體間的遺傳距離為0.182 7～ 0.223 9, 4個非長樂群體的遺傳距離為0.068 3～0.136 7。AMOVA分析結(jié)果顯示遺傳分化大部分（68.7%）來自于群體內(nèi)。其余的遺傳分化來自于種群間。長樂群體和非長樂群體（QD, BH, JN, LYG）的遺傳分化值（Gst=0.309 0～0.364 9）較高, 而非長樂群體間的Gst較低（0.148 2～0.240 3）, 說明長樂群體有明顯的遺傳分化。本研究發(fā)現(xiàn)廣西群體與北方群體親緣關(guān)系近, 與福建群體親緣關(guān)系遠(yuǎn), 這與一般規(guī)律不符。

尤仲杰等[9]用 RAPD標(biāo)記對我國山東膠南（JN）,江蘇南通（NT, 即啟東）, 浙江臺州（TZ）, 福建福州（FZ, 即長樂）, 廣西北海（BH）5個自然群體西施舌的遺傳差異進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和RAPD分析, NJ法聚類分析顯示北海群體與福州群體聚為一支, 用 UPGMA法聚類顯示, 北海群體單獨為一支。尤仲杰認(rèn)為北海群體可能已經(jīng)形成了地理群體。黎中寶[10]用等位酶對啟東、福建漳港、廣西北海 3個地理群體的西施舌生化遺傳多樣性進(jìn)行了研究, 結(jié)果顯示, 漳港群體與北海群體聚為一支, 啟東群體為單獨一支。林昕[15]對啟東、福建長樂和深滬灣三個地理群體的西施舌進(jìn)行了ITS1分析, 發(fā)現(xiàn)江蘇西施舌與福建西施舌遺傳距離較大, 但未形成區(qū)別于其他地區(qū)西施舌的獨特的種?？琢钿h等[6-8]用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)、AFLP和16S分子標(biāo)記對北方的4個地理群體（即墨、膠南、日照和啟東）與福建的 2個群體（長樂、漳港）的遺傳差異進(jìn)行了研究, 認(rèn)為福建的西施舌與北方的 4個群體存在明顯的遺傳差異, 聚類時明顯的分為兩支,北方的 4個群體聚為一支, 福建的 2個群體聚為一支。本研究聚類分析發(fā)現(xiàn)西施舌 CL群體聚為一支,這與孔令鋒的結(jié)果一致, 與黎中寶、林晰的結(jié)果不完全一致, 但本研究顯示西施舌群體間遺傳關(guān)系與其所處的地理位置遠(yuǎn)近不完全相符。廣西群體（北海）與北方的3個群體（QD, JN, LYG）聚在一起, 這與尤仲杰的結(jié)果相反。廣西群體與福建群體地理位置近,易發(fā)生基因交流, 因此應(yīng)該與福建群體遺傳關(guān)系近,或形成特殊的地理群體, 但本研究的結(jié)果顯示它與北方群體親緣關(guān)系近, 與福建CL群體親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

到目前為止, 我國學(xué)者從形態(tài)學(xué), 生物化學(xué)（同工酶）和分子生物學(xué)（RAPD, AFLP, ITS1, 16S rRNA基因）等多個方面對西施舌群體遺傳多樣性及遺傳差異進(jìn)行了研究, 大多數(shù)結(jié)果認(rèn)為福建群體（包括長樂,神戶灣、漳州等群體）遺傳結(jié)構(gòu)獨特, 但廣西群體的分類地存在分歧。因此, 廣西群體的系統(tǒng)發(fā)生地位仍不明朗, 需用其他分子標(biāo)記作深入的研究。我國西施舌分布于大連、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西等沿海地區(qū)。但福建長樂的西施舌個體大, 品質(zhì)好, 也有其獨特的分子標(biāo)記。本研究的RAPD引物中, S299引物擴(kuò)增出的約 600bp條帶為長樂群體所特有, 且穩(wěn)定清晰, 可作為鑒定長樂群體的分子標(biāo)記。其他群體無典型的共享RAPD條帶。

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Received: Nov., 18, 2009

Key words:Coelomactra antiquata: genetic structure: RAPD

Abstract:The Randomly Amplified Polymorphic DNA （RAPD） technique was applied to assess the genetic variations among five stocks [Changle （CL）, Qidong （QD）, Lianyungang （LYG）, Shandong （JN） and Guangxi （BH）] ofCoelomactra antiquatausing 55 random primers. Genetic diversity was analyzed with PopGen （Version 1.31）software. A total of 12 highly reproducible primers and 88 clear and stable bands were obtained. The lengths of amplified fragments were from 100 bp to 3000 bp. The primer S299, which amplified 600 bp fragment, was specific to the CL stock. The proportion of polymorphic loci was from 62.07% to 78.26% and Shannon index was from 0.210 5 to 0.312 3. Genetic distance among five stocks was from 0.068 3 to 0.223 9. The genetic distance between the CL stock and the other four stocks was 0.182 7～0.223 9, and the genetic distance among the four non-CL stocks was 0.068 3～0.136 7. Coefficient of genetic differentiation among stocks （Fst） was 0.31301 （P＜0.05）, indicating the genetic variation among stocks accounted for 31.30%. The value of genetic differentiation （Gst） between CL and the other four stocks were 0.364 9, 0.344 8, 0.325 0, and 0.309 0 for QD, BH, JN, and LYG, respectively. The values of genetic differentiation （Gst） among non-CL stocks were 0.148 2～0.240 3. The above data show that the maximum genetic differentiation occurred in the CL stock. Phylogenetic analysis shows that QD and JN stocks formed a clade,which subsequently clustered with BH stock, and then got together with LYG stock. Meanwhile CL stock formed one separate clade.

（本文編輯:張培新）

RAPD analysis of genetic structure and differentiation of Coelomactra antiquata

MENG Xue-ping1, WANG Shuai2, GAO Ru-cheng2, SHEN Xin1, CHENG Han-liang1,TIAN Mei1
（1. Marine School of Huaihai Institute of Technology, Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Lianyungang 222005, China; 2. College of Life Sciences of Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China）

Q951+.3

A

1000-3096（2011）02-0006-04

2009-11-18;

2010-04-13

江蘇省自然科學(xué)基金項目（BK2007066）; 國家 863計劃項目（2004AA603140）; 江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室開放課題（2005HS009, 2009SH13）; 江蘇省教育廳自然科學(xué)基金項目（05SJD240028）作者簡介: 孟學(xué)平（1955-）, 男, 碩士, 內(nèi)蒙古商都縣人, 教授, 主要從事水生生物生化及分子生物學(xué)研究, E-mail: mxp2002@hotmail.com, 電話: 0518-85890806