石開儀，許 寧，陶秀祥，洪芬芬

(1.中國礦業(yè)大學(xué)煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，江蘇徐州 221008;2.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221008;3.宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，安徽宿州 234000)

·開發(fā)與研究·

白腐真菌Hyprocrea lixii AH的產(chǎn)酶特性研究

石開儀1，2，許 寧3，陶秀祥1，2，洪芬芬1，2

(1.中國礦業(yè)大學(xué)煤炭加工與高效潔凈利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ，江蘇徐州 221008;2.中國礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，江蘇徐州221008;3.宿州學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)院，安徽宿州 234000)

為了確定白腐真菌(H.lixii AH)在SMA培養(yǎng)基中的最佳產(chǎn)酶條件，利用正交試驗(yàn)研究了藜蘆醇、Cu2+以及表面活性劑(吐溫)的用量對(duì)真菌H.lixii AH生長和產(chǎn)酶的影響。發(fā)現(xiàn)吐溫80和低濃度Cu2+對(duì)真菌的生長有促進(jìn)作用，過氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影響最大，優(yōu)選濃度均是0.2g/L。LiP、MnP和Lac受吐溫的影響較顯著，添加吐溫60后，LiP和MnP活性分別提高了11.7%和38%，而Lac有所下降。

白腐真菌;哈茨木霉;產(chǎn)酶;活性;正交試驗(yàn)

Abstract:In ordor to determine the optimum enzyme production condition of white rot fungus hyprocrea lixii AH in SMA medium，the effect of the amount of veratryl alcohol，Cu2+and surfactunt to H.lixii AH growthing and its enzyme production are studied by orthogonal experiment.The result shows，the tween 80and lower concentration Cu2+has promoting effect to fungus growthing，the effect of Cu2+to peroxidase and polyphenol oxidase are maximum，the optimal selecting concentration of Cu2+all is 0.2g/L.The effect of tween to LiP，MnP and Lac is significant，after adding tween 80，the activity of LiP and MnP improve respectively 11.7%and 38% ，but the activity of Lac decreases somewhat.

Key words:white rot fungus;enzyme production;activity;orthogonal experiment;hamington baraki enayme

白腐真菌因其具有降解各種不同結(jié)構(gòu)的天然及合成化學(xué)物質(zhì)的能力，因而吸引國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注［1］。白腐真菌在環(huán)境保護(hù)中，如造紙廢水處理［2］、土壤污染治理、重金屬污染治理［3］等方面，均得到很好的應(yīng)用。白腐真菌對(duì)大分子化合物的降解主要是酶起作用［4－5］，其中木質(zhì)素降解酶系［6］起著關(guān)鍵性作用。本文主要研究本實(shí)驗(yàn)室篩選的一株具有煤炭降解能力的白腐真菌的產(chǎn)酶特性，主要研究了酶激活劑(黎蘆醇、Cu2+)和表面活性劑(吐溫)對(duì)產(chǎn)酶的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

采用實(shí)驗(yàn)室篩選并保存的白腐真菌，命名為真菌Hyprocrea.lixii AH，通過16s rDNA測定屬于哈茨木霉。實(shí)驗(yàn)中采用SMA培養(yǎng)基，其組成為:麥芽糖40g，蛋白胨 10g，瓊脂 20g，水 1000mL，自然pH值。

1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為提高真菌酶活性，考察了藜蘆醇、Cu2+以及表面活性劑對(duì)真菌H.lixii AH產(chǎn)酶和煤炭降解的影響。正交試驗(yàn)因素、水平如表1所示。

表1 產(chǎn)酶正交試驗(yàn)因素水平表

采用3因素3水平正交表。試驗(yàn)中用兩組平行樣，分別標(biāo)號(hào) 1、2、3、4、5、6、7、8、9。試驗(yàn)從接種開始每隔一定時(shí)間分別測量各組的菌落大小以判斷各組生長情況，再過1～2d開始測酶活。

1.3 酶活性的測定

過氧化物酶和多酚氧化酶活性的測定按照文獻(xiàn)進(jìn)行，木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶的活性按照文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加劑對(duì)真菌生長的影響

首先考察了不同濃度的藜蘆醇和銅離子以及不同表面活性劑對(duì)真菌生長和產(chǎn)酶的影響。由菌絲生長圖(圖1)可知，3號(hào)生長最快，4號(hào)和8號(hào)生長最慢。與圖2未優(yōu)化前的菌體生長比較可以看出，3號(hào)和6號(hào)比未優(yōu)化前生長要快。3號(hào)和6號(hào)都加入的是吐溫80，9號(hào)同樣加吐溫80，也生長比較快。由此可推測，吐溫80可以促進(jìn)真菌H.lixii AH生長。生長較慢的幾組試驗(yàn)的Cu2+濃度都較大，可能當(dāng)Cu2+濃度大于0.2g/L時(shí)，菌體生長受到抑制。

圖1 優(yōu)化培養(yǎng)基中真菌H.lixii AH的生長

圖2 未優(yōu)化培養(yǎng)基中菌絲生長速度

2.2 酶活性的變化

根據(jù)正交試驗(yàn)表1進(jìn)行試驗(yàn)，測定各酶活性，結(jié)果如表2所示。

表2 SMA優(yōu)化培養(yǎng)基中的酶活性 U

2.2.1 以過氧化物酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析

以過氧化物酶的活性為指標(biāo)的分析表如表3和表4所列。

表3 以過氧化物酶為指標(biāo)的直觀分析表

表4 以過氧化物酶為指標(biāo)的方差分析表

由表4可以看出，Cu2+對(duì)真菌H.lixii AH的過氧化物酶活性的影響最為顯著，吐溫的影響較顯著，藜蘆醇影響最小。直觀分析(表3)表明，A因素(藜蘆醇)以第一水平、B因素(吐溫)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為1mmol/L，吐溫20，Cu2+濃度為0.2g/L 時(shí)，SMA 培養(yǎng)基的過氧化物酶的活性最大，達(dá)1377U，比未添加試劑的688.5U的提高了一倍。

2.2.2 以多酚氧化酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析

以多酚氧化酶為指標(biāo)的正交分析表如表5和表6所示。由表6可以看出，H.lixii AH的多酚氧化酶活性也是受Cu2+的影響最為顯著，而藜蘆醇和吐溫的影響都一般。直觀分析(表5)表明，A因素(藜蘆醇)以第二水平、B因素(吐溫)以第一水平、C因素(Cu2+)以第一水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為3mmol/L，吐溫20，Cu2+用量為0.2g/L 時(shí)，SMA 培養(yǎng)基中的多酚氧化酶活最大，為324U，然而卻比未添加上述試劑的364.5U有所降低。2.2.3 以LiP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析

表5 以多酚氧化酶為指標(biāo)的直觀分析表

表6 以多酚氧化酶為指標(biāo)的方差分析表

以LiP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析如表7和表8所示。

表7 以LiP為指標(biāo)的直觀分析表

表8 以多酚氧化酶為指標(biāo)的方差分析表

由表8可知，藜蘆醇的濃度H.lixii AH分泌的LiP活性的影響最為顯著，吐溫次之，Cu2+濃度影響最小。由表7的直觀分析表明，藜蘆醇濃度以第三水平、吐溫以第二水平、Cu2+濃度以第一水平或第三水平最好。即當(dāng)藜蘆醇為5mmol/L，吐溫60，Cu2+用量為0.2g/L或0.08g/L時(shí)即低濃度時(shí)，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的LiP酶活最大，其活力為11.79U，比未添加上述試劑的10.556U提高了11.7%。

2.2.4 以MnP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析

以MnP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析如表9和10所示。由表10可發(fā)現(xiàn)，吐溫對(duì)H.lixii AH的MnP活性的影響最為顯著，藜蘆醇和Cu2+的影響一般。表9的直觀分析表明，A因素以第二水平、B因素以第二水平、C因素以第三水平最好。即當(dāng)藜蘆醇濃度為 3mmol/L，吐溫 60，Cu2+濃度為 0.08g/L 時(shí)，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的MnP活性最大，為6.728U，比未添加試劑的4.875U提高了38.4%。

表9 以MnP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)直觀分析表

表10 以MnP為指標(biāo)的正交試驗(yàn)方差分析表

2.2.5 以漆酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析

以漆酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)分析見表11和12。

表11 以漆酶為指標(biāo)的直觀分析表

表12 以漆酶為指標(biāo)的方差分析表

由表12可知，吐溫對(duì)H.lixii AH分泌的漆酶活性的影響最顯著，藜蘆醇和Cu2+濃度的影響一般。表11的直觀分析表明，藜蘆醇以第一水平、吐溫以第二水平、Cu2+以第二水平最好。即當(dāng)藜蘆醇濃度為 1mmol/L，吐溫 60，Cu2+濃度 0.5g/L時(shí)，SMA培養(yǎng)基中H.lixii AH的漆酶酶活性最大，為15.83U，但是比未添加上述試劑的21.25U有所降低。

3 結(jié)果與討論

利用正交試驗(yàn)考察了Cu2+濃度、黎蘆醇濃度和吐溫在SMA培養(yǎng)基中對(duì)真菌H.lixii AH的上述各種酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同胞外酶受到以上條件影響情況有所差異。過氧化物酶和多酚氧化酶受Cu2+影響最大，優(yōu)選濃度均是0.2g/L。其中，過氧化物酶受到激活，多酚氧化酶稍受抑制。LiP、MnP和Lac受吐溫的影響較顯著，選用吐溫60。添加吐溫60后，LiP活性提高了11.7%，MnP活性提高了38%，然而Lac的酶活性略有下降。高濃度黎蘆醇促進(jìn)LiP的分泌，而對(duì)其他胞外酶的活性有抑制作用。

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Study on Characteristic of Enzyme Production of White－rot Fungus Hyprocrea Lixii AH

SHI Kai－ yi，2，XU Ning，TAO Xiu － xiang，2，HONG Fen － fen，2
(1.State Key Laboratory of Coal Conversion，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;2.School of Chemical and Engineer，China University of Mining and Technology，Xuzhou 221008，China;3.School of Chemical and Life Sciences，Suzhou University，Suzhou 234000，China)

TQ426.97

A

1003－3467(2011)05－0029－041311

2011－03－01

國家自然科學(xué)基金資助(50374068);國家自然科學(xué)基金委員會(huì)創(chuàng)新研究群體科學(xué)基金資助項(xiàng)目(50921002);中國礦業(yè)大學(xué)科技基金資助(E200407);宿州學(xué)院碩士科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(2009YSS11)。

石開儀(1983－)，男，在讀博士，從事煤炭生物液化方面的研究，電話:15094356744;陶秀祥，教授，電話:(0516)83591057。