杜 楓， 金 鳳 燮， 魚 紅 閃

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

人參的有效成分主要包括人參皂苷、多糖等[1]。人參皂苷在延緩衰老和治療老年性疾病及其引起的認(rèn)知性功能障礙和性功能障礙等方面均有很好的療效，并且具有抑制腫瘤的生長、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用[2-3]。人參皂苷是由糖和苷元相連而成的糖苷類化合物[4]。其中Rb1、Rd、Re等皂苷含量較高，而Rh1，Rh2和C-K等則非常稀有。本實(shí)驗(yàn)室篩選出的AbsidiaSp.R84g菌株所產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶可以水解Rb1為F2和C-K，此酶暫命名為人參皂苷葡萄糖苷酶，英文縮寫為GluGF。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)測得該酶的最適酶反應(yīng)溫度為30 ℃、最適酶反應(yīng)pH為5.0，酶蛋白分子質(zhì)量約為71 ku，但其基因未知。本文應(yīng)用RACE法調(diào)取該菌株產(chǎn)GluGF基因。

1材料方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

Absidiasp.R84g菌株由大連工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院菌種保藏所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用麩皮浸出液40 mL +人參浸出液60 mL，經(jīng)過121 ℃、20 min高壓高溫滅菌后使用。

1.1.3 設(shè)備儀器

電泳儀，高速冷凍離心機(jī)，PCR儀，快速離心機(jī)，紫外分析儀，快速混勻器，分光光度計。

1.1.4 主要試劑

TaKaRa RNAiso Reagent，Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit， TaKaRa LA Taq，DNaseI(RNase Free)，RNase Inhibitor，DNA Marker，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit, High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit等,Takara公司；苯酚、氯仿、乙醇、瓊脂糖，異戊醇等,科密歐(天津)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 簡并引物

根據(jù)測得的人參皂苷葡萄糖苷酶蛋白N端序列ATLDSWLSNEATVAR，并借助軟件Primer Premier 5.0[6]試劑盒中找到相應(yīng)的5′-CDS Primer與3′-CDS Primer。

1.2.2 總RNA的提取和檢測

使用RNAiso Reagent提取總 RNA：菌體經(jīng)低溫凍結(jié)后加入適量液氮后研磨，滴加RNAiso勻漿并于室溫下靜置5 min隨后滴加氯仿(1/5 RNAiso體積)，于室溫下靜置5 min再經(jīng)由12 000 r/min 4 ℃離心15 min，然后移至新離心管滴加等體積的異丙醇，于室溫下靜置10 min，再經(jīng)由12 000 r/min 4 ℃離心10 min并向沉淀中滴加乙醇，然后12 000 r/min 4 ℃離心5 min后棄上清，將沉淀用適量DEPC水溶解，取1 μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增出cDNA片段

使用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，同時設(shè)立M-MLV(-)對照。

5′RACE：反應(yīng)體系中含有RNA，5′-CDS Primer，BD SMART A oligo, Sterile H2O反應(yīng)所采用的條件為70 ℃，2 min，反應(yīng)結(jié)束后立即放置于冰上2 min。隨后加入5×First-Strand Buffer、200 μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)，dNTP(10 mmol/L)與DTT(20 mmol/L)繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)所采用的條件為42 ℃、90 min，滴加100 μL Tricine-EDTA buffer繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)條件為72 ℃、7 min。

3′RACE：反應(yīng)體系中含有RNA、3′-CDS Primer、Sterile H2O，反應(yīng)條件為70 ℃、2 min。反應(yīng)后立即冰上放置2 min，加入5× First-Strand Buffer、200 μL Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H)，DTT(20 mmol/L)和dNTP(10 mmol/L)繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)條件為42 ℃、90 min，然后加入100 μL Tricine-EDTA buffer繼續(xù)反應(yīng)，反應(yīng)條件為72 ℃、7 min。

1.2.4 cDNA3′、5′RACE法全長擴(kuò)增

1.2.4.1 引物設(shè)計

使用軟件Primer Premier 5.0[5]，根據(jù)RT-PCR得到的cDNA片段，同時參考真菌偏愛的密碼子，設(shè)計特異性引物如下：

3′RACE上游外側(cè)引物F3：

5′-CCCTTTTAGACGCAACTGAGAGC-3′

23 mers

3′RACE上游內(nèi)側(cè)引物F4：

5′-CCCAGCATCATTACTCCTCAGCA-3′

23 mers

5′RACE R1：

5′-AGC NAC NGT NGC YTC RTT-3′

18 mers

1.2.4.2 Outer PCR反應(yīng)

根據(jù)5′和3′-Full RACE 試劑盒的操作手冊中的方法，分別配置含5′RACE Outer Primer、LA Taq，3′RACE Outer Primer以及特異性引物F3、F4，R1的Outer PCR反應(yīng)液，采用反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)。

1.2.4.3 Inner PCR反應(yīng)

根據(jù)5′和3′-Full RACE Kit的操作手冊中的方法，采用Outer PCR反應(yīng)中得到的產(chǎn)物作為模板進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)。分別取反應(yīng)液5 μL，應(yīng)用3%和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.4.4 產(chǎn)物回收及測序

采用產(chǎn)物回收試劑盒中提供的手冊中的方法，進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收操作，并送交TaKaRa公司進(jìn)行序列測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 總RNA提取結(jié)果檢測

用“1.2.2”的方法提取總 RNA，采用RNA純化法除去樣品中的染色體DNA。純化后取1 μL進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，染色體DNA已基本被除去，RNA條帶清晰，完整性較好。測得A260/A280約為1.95，可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。

1，DNase I處理的總RNA；M，DL 2000 DNA Marker

2.2 cDNA 3′、5′ RACE法全長擴(kuò)增結(jié)果

2.2.1 cDNA 5′RACE擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的片段，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行3%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，在250 bp處以下有清晰條帶。對PCR產(chǎn)物切膠回收，測序得長度為154 bp。

1，5′RACE PCR產(chǎn)物；2，M-MLV(-)對照；M，DL 2000 DNA Marker

2.2.2 cDNA 3′RACE擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA片段，進(jìn)行套式PCR反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，吸取5 μL反應(yīng)液采用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見圖3。由圖3可以看出在2 000 bp左右有清晰條帶。對PCR產(chǎn)物切膠回收，測序得長度為1 920 bp。

1，3′RACE PCR產(chǎn)物；2，M-MLV(-)對照；M1，DL 2000 DNA Marker；M2，λ-Hind Ⅲ DNA Marker

2.3 產(chǎn)物GluGF基因全序列的獲得

根據(jù)實(shí)驗(yàn)測得的5′和3′RACE產(chǎn)物序列，再次設(shè)計引物進(jìn)行二次RT-PCR得到反應(yīng)液，取1 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出在2 000 bp處有清晰條帶。

1，二次RT-PCR產(chǎn)物； M，DL 2000 DNA Marker

將得到的二次RT-PCR產(chǎn)物測序得到產(chǎn)GluGF基因全序列。應(yīng)用SequencherTM軟件分析確定其CDS區(qū)并翻譯成氨基酸序列，包括640個氨基酸，CDS區(qū)全長為1 923 bp。使用Propsearch軟件計算其組成的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為70.4 ku，與實(shí)驗(yàn)前期得到的人參皂苷葡萄糖苷酶的分子質(zhì)量71 ku基本一致，因此可以認(rèn)定所得到的序列是目的基因的序列。

3 結(jié) 論

根據(jù)人參皂苷糖苷酶的N端氨基酸序列設(shè)計簡并引物，以RT-PCR得到cDNA片段，采用3′與5′端的特異性引物，以菌種總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到cDNA3′及5′末端的基因序列，進(jìn)而得到目的基因的CDS區(qū)全序列。將得到的序列翻譯成氨基酸，經(jīng)計算可知由其編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為70.4 ku，與前期實(shí)驗(yàn)純化出的人參皂苷糖苷酶的分子質(zhì)量71 ku基本一致，可以認(rèn)定所得目的基因的CDS區(qū)全序列是正確的。

[1] 白龍律,臧蘊(yùn)霞,尹成日. 微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1為Rg3的研究[J]. 延邊大學(xué)學(xué)報, 2009, 35(2):141-144.

[2] SHIBATA S. Future development of ginseng studies[M]. Tokyo:Hirokawa Publishing Company, 1989:145-148.

[3] 張均田. 人參研究的回顧和展望[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1995, 30(5):321-325.

[4] 張怡軒,陳曉瑩,趙文倩. 人參皂苷生物轉(zhuǎn)化的研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2008, 25(5):419-422.

[5] 任亮,朱寶芹,王海燕,等. 利用軟件Primer Premier 5. 0進(jìn)行PCR引物設(shè)計的研究[J]. 錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2004, 25(6):43-46.