趙 睿， 王 曉 丹， 祖 國(guó) 仁， 趙 長(zhǎng) 新

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

膠原蛋白是動(dòng)物體最重要的蛋白質(zhì)之一，是結(jié)締組織極重要的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)[1]。我國(guó)在水產(chǎn)市場(chǎng)上存在大量鱈魚皮，而鱈魚皮中存在大量的膠原蛋白。關(guān)于鱈魚皮中膠原蛋白的提取方法在之前的研究中未見報(bào)道，如果能從這些廢棄的鱈魚皮中提取膠原蛋白加以利用，可減少環(huán)境污染，獲得更安全的膠原蛋白[2]。

在以往的研究中，膠原蛋白的提取方法主要是酸提取法和酶提取法[3]。但酸法對(duì)膠原的損傷嚴(yán)重，難以獲得較高質(zhì)量的產(chǎn)品；而酶法引入外源蛋白，會(huì)對(duì)膠原蛋白的提純?cè)斐捎绊憽１疚牟捎眠^程簡(jiǎn)單、便于操作的熱水抽提法[4]，以鱈魚加工的廢棄物魚皮作為研究材料，考查不同的水解溫度、pH及水解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響，為我國(guó)水產(chǎn)品加工業(yè)的下腳料以及皮革行業(yè)產(chǎn)生的大量廢棄物的利用和開發(fā)提供了綠色化工的有效途徑，找出了較為經(jīng)濟(jì)的水解方法。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

鱈魚皮，購(gòu)于大連市場(chǎng)；正己烷、0.2%NaOH溶液、0.2%硫酸、檸檬酸、pH試紙、硝酸銀溶液等試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

JM-250小型電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；KDN-05A蛋白質(zhì)測(cè)定儀，上海貝特儀電設(shè)備廠；GTL-16A高速離心機(jī)，上海浦東物理光學(xué)儀器廠。

1.3 方 法

1.3.1 膠原蛋白的提取

1.3.1.1 魚皮的預(yù)處理

將魚皮去除魚鱗魚肉，洗凈風(fēng)干后，剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放入冰箱備用。

去脂肪：魚皮中加入其質(zhì)量30倍的20%的正己烷溶液(料液比1∶30)，加入表面活性劑于4 ℃下攪拌浸泡24 h，然后用蒸餾水反復(fù)清洗。

去雜蛋白：用0.2%的NaOH浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性；然后用0.2%的硫酸浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性；最后用1%的檸檬酸浸泡魚皮40 min，攪拌，去離子水清洗至pH為中性。

1.3.1.2 熱水法提取膠原蛋白

將2 g左右的魚皮放入燒杯中，按料液比為1∶100加入去離子水，設(shè)置溫度，用磁力攪拌器邊攪拌邊加熱保溫。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，魚皮中的膠原蛋白，慢慢變性溶出。

1.3.2 魚皮水解液中膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算

用考馬斯亮藍(lán)的方法，使用可見光分光光度計(jì)測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù)測(cè)出的蛋白質(zhì)量和煮出溶液的體積計(jì)算膠原蛋白中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)所用魚皮中蛋白質(zhì)的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算出膠原蛋白的得率。

1.3.3 魚皮可溶性膠原的SDS-PAGE電泳測(cè)定

采用LaemmLi[5]的方法，用8%的分離膠和5%的濃縮膠，樣品上樣量為30 μL。電極緩沖液為0.05 mol/L的Tris-Gly緩沖液。

1.3.4 提取液中羥脯氨酸含量的測(cè)定

1.3.4.1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)測(cè)得的不同質(zhì)量濃度羥脯氨酸的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

1.3.4.2 樣品中膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的計(jì)算

X=a×11.1/m

式中，X為樣品中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；a為測(cè)定液中羥脯氨酸的質(zhì)量濃度，mg/mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，g；11.1為膠原蛋白水解為羥脯氨酸的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白的提取

2.1.1 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

將經(jīng)過預(yù)處理后的魚皮按1∶100加入去離子水，放在磁力攪拌器上進(jìn)行加熱保溫并攪拌。由圖2可以看出膠原蛋白的提取率在pH為2～4時(shí)提取率均較低，而在pH 5左右達(dá)到最大。

圖2 pH對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.2 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

從圖3中可看出，30～40 ℃時(shí)魚皮的蛋白提取率逐漸增高，40～60 ℃時(shí)的提取率逐漸下降。溫度在從30 ℃升高到40 ℃的過程中，膠原蛋白的水解速度加快，但當(dāng)溫度過高時(shí)，膠原蛋白肽鏈的斷裂也急速加劇，產(chǎn)生大量的肽鏈片段，膠原蛋白的提取率也隨之下降。

圖3 溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

由圖4可以看出，提取時(shí)間在12～24 h時(shí)，膠原蛋白的提取率逐漸提高，24～36 h時(shí)提取率基本平穩(wěn)，在36 h之后膠原蛋白的提取率有所下降，可能是由于水解時(shí)間過長(zhǎng)，破壞了膠原肽鏈，所以提取率反而下降。

圖4 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件

選取溶液pH(X1)、抽提溫度(X2)和抽提時(shí)間(X3)作為考察因素，膠原蛋白的提取率作為指標(biāo)。數(shù)據(jù)如表1所示。水抽提過程中pH、溫度和時(shí)間之間相互作用對(duì)指標(biāo)值的影響采用響應(yīng)面圖分析，結(jié)果如圖5所示。當(dāng)自變量逐漸接近中心點(diǎn)時(shí)，膠原蛋白的提取率逐漸提高。3個(gè)因素對(duì)提取率影響關(guān)系為X3>X2>X1，即時(shí)間(X3)對(duì)膠原蛋白提取率的影響較大。

表1 pH、溫度、時(shí)間的編碼處理

圖5 pH(X1)、溫度(X2)和抽提時(shí)間(X3)對(duì)膠原蛋白提取率的影響

y=-9.043 10E-04X1+0.106 715X2+

0.085 656X3-0.293 958X12-

0.342 179X22-0.349 687X32-

0.035 450X1X2+0.063 791 4X1X3+

0.085 029 3X2X3+0.840 337

解得X1=0.003 546，X2=0.173 6，X3=0.143 9。計(jì)算得膠原蛋白提取最佳工藝為溫度41.74 ℃(取42 ℃)、pH 5.0、抽提時(shí)間25.72 h，將X1、X2、X3帶入方程解得y值為85.86%，在此實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)得膠原蛋白的實(shí)際提取率為83.75%，與理論值相差不大。

2.3 鱈魚皮膠原蛋白的分子質(zhì)量分布

膠原蛋白包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型等。其中Ⅰ型由兩條相同的α1(Ⅰ)和一條不同的α2(Ⅰ)肽鏈構(gòu)成，即[α1(Ⅰ)]2α2(Ⅰ)。采用SDS-PAGE觀察膠原蛋白分子中α鏈的分布，如圖6所示。

A、B，樣品；C，標(biāo)準(zhǔn)品

鱈魚皮的水解液中至少含有兩條不同的α鏈(α1和α2)及其聚合鏈，分子質(zhì)量都在100 ku以上。條帶α1內(nèi)可能含有α3，但在SDS-PAGE上無(wú)法辨別。α1和α2兩個(gè)不同亞基的存在證實(shí)了鱈魚皮中膠原蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白。

3 結(jié) 論

經(jīng)過響應(yīng)面法優(yōu)化之后得出了膠原蛋白提取的最佳工藝條件為pH 5.0、溫度42 ℃、提取時(shí)間25.72 h。最優(yōu)條件下膠原蛋白的提取率為83.75%，鱈魚皮中的膠原蛋白主要為Ⅰ型。

[1] 史京京,陳麗娟,王穎,等. 膠凍強(qiáng)度與明膠α組份關(guān)系的研究[J]. 感光科學(xué)與光化學(xué), 2002, 20(6):462-467.

[2] NOMURA Y, SAKAI H, ISHII Y, et a1. Preparation and some properties of type I collagen from fish scales[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1996, 60:2092-2094.

[3] 劉曉寧，劉安軍，曹東旭，等.魚鱗膠原蛋白的提取鑒定初探[J].食品研究與開發(fā)， 2007, 28(1):56-60 .

[4] 林家福，謝福美，易美華，等.熱水提取羅非魚魚皮膠原蛋白的研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)， 2008, 8(8):1317-1318,1328。

[5] 李建武,蕭能庚,余瑞元,等. 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)原理和方法[M]. 北京:北京大學(xué)出版社, 1997:165-266.