李 德，唐 兵，楊大春，馬雙陶，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，成都 610083)

Ⅱ型膠原酶加壓灌流提高成年大鼠心肌細(xì)胞分離效率

李 德，唐 兵，楊大春，馬雙陶，楊永健

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，成都 610083)

目的 探討效率更高的成熟心肌細(xì)胞分離方法。方法 采用Ⅱ型膠原酶升主動(dòng)脈逆行灌流法分離成年大鼠心肌細(xì)胞。對(duì)照組采用Langendorff裝置灌流;實(shí)驗(yàn)組在Langendorff裝置基礎(chǔ)上加壓勻速灌流。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并計(jì)算桿狀細(xì)胞比率及產(chǎn)量;通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色和局部場(chǎng)剌激評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞活性。結(jié)果 分離即刻，實(shí)驗(yàn)組桿狀細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組【(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01】;實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞產(chǎn)量也顯著高于對(duì)照組［(3.6±0.7) ×107νs.(1.9±0.6) ×107，P＜0.01］。復(fù)鈣過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生自發(fā)性收縮的細(xì)胞比率及變圓細(xì)胞比率均明顯低于對(duì)照組【(10.4±2.1)% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05】。實(shí)驗(yàn)組臺(tái)盼藍(lán)染色陰性的桿狀細(xì)胞比率和局部場(chǎng)剌激條件下收縮細(xì)胞比率明顯高于對(duì)照組【(95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01】。結(jié)論 Ⅱ型膠原酶加壓灌流可獲得高產(chǎn)量、高活性的心肌細(xì)胞，提高了成熟心肌細(xì)胞的分離效率。

大鼠;心肌細(xì)胞;細(xì)胞分離

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，8～10周齡，體質(zhì)量200～250 g，來(lái)源于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(渝)2007-0003】，所有實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各10只大鼠。

1.2 試劑

II型膠原酶購(gòu)自 Sigma公司(美國(guó));HEPES、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Gibco公司(美國(guó));其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 主要液體配制

1.3.1 無(wú)鈣臺(tái)氏液配方 (mmol/L)：NaC1 36、KCl 5.4、NaH2PO40.33、MgC12·6 H2O 1.0、葡萄糖 10、HEPES 10，以 NaOH調(diào)整 pH=7.4。

1.3.2 0.05% Ⅱ型膠原酶：15 mgⅡ型膠原酶、30 mg BSA，溶于300 mL無(wú)鈣臺(tái)氏液。

1.3.3 KB 液配方(mmol/L)：KOH 20、谷氨酸鉀 50、KCl 40、牛黃酸20、KH2PO420、MgC12·6 H2O 3、HEPES 10、葡萄糖 10、EGTA 0.5，以 KOH 調(diào)整 pH=7.4。

1.3.4 復(fù)鈣用無(wú)鈣臺(tái)氏液：每100 mL無(wú)鈣臺(tái)氏液中加入牛黃酸0.25 g、BSA 50 mg;180 mmol CaCl2貯存液：1.998 g無(wú)水CaCl2溶于100 mL三蒸水。

1.3.5 1.8 mmol CaCl2臺(tái)氏液：復(fù)鈣用無(wú)鈣臺(tái)氏液9.9 mL加入 180 mmol CaCl2貯存液 100 μL。

1.3.6 0.18 mmol CaCl2臺(tái)氏液：復(fù)鈣用無(wú)鈣臺(tái)氏液9 mL加入1.8 mmol CaCl2鈣臺(tái)氏液1 mL。所有液體均用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.4 心肌細(xì)胞的分離

整個(gè)操作過(guò)程在超凈臺(tái)中進(jìn)行。Langendorff裝置各部件高溫、高壓滅菌，連接管用環(huán)氧乙烷消毒。適當(dāng)設(shè)置Langendorff溫度，使終端灌流液的溫度保持在37℃。兩灌流瓶中分別預(yù)充無(wú)鈣臺(tái)氏液和0.05%II型膠原酶。灌流前灌流液預(yù)充混合氣體(95%O2和5%CO2)15 min，并且整個(gè)灌流過(guò)程中持續(xù)充氣。SD大鼠腹腔注射戊巴妥鈉(35 mg/kg)和肝素液1 mL(1000 U/mL)。麻醉顯效后，仰臥位固定于蛙板，75%酒精消毒胸腹部皮膚?！癠”形剪開(kāi)皮膚及胸壁暴露縱隔，于降主動(dòng)脈段快速離斷主動(dòng)脈，取出心臟，置于4℃無(wú)鈣臺(tái)氏液，輕輕擠出心腔內(nèi)血液，將心臟懸掛于灌流裝置，經(jīng)升主動(dòng)脈逆行灌注無(wú)鈣臺(tái)氏液和膠原酶消化液。對(duì)照組采用Langendorff裝置灌流(圖1)。先以無(wú)鈣臺(tái)氏液灌流5 min，沖洗冠脈中的殘留血液，并且解離心肌細(xì)胞之間Ca2+依賴的緊密連接，然后用0.05%II型膠原酶循環(huán)灌流20 min或直到心臟明顯變軟、略帶微黃(圖2)。實(shí)驗(yàn)組在改良Langendorff裝置基礎(chǔ)上用注射器輔助加壓勻速灌流(圖3)，流量25 mL/min，其余操作同對(duì)照組。剪下心室組織置于KB液中，撕去心外膜，用眼科鑷將心肌撕成小塊。轉(zhuǎn)入50 mL離心管中，用吸管輕輕吹打數(shù)次。200目濾網(wǎng)過(guò)濾后室溫靜置10 min，去上清。圖1～3見(jiàn)封三。

1.5 心肌細(xì)胞梯度復(fù)鈣

加入0.18 mmol CaCl2臺(tái)氏液10 mL重懸細(xì)胞，靜置10 min，細(xì)胞自然沉降;吸除上清5 mL，再加入1.8 mmol CaCl2臺(tái)氏液 5 mL重懸細(xì)胞，靜置 10 min，細(xì)胞自然沉降，去上清;加入1.8 mmol CaCl2臺(tái)氏液10 mL重懸細(xì)胞，靜置10 min，細(xì)胞自然沉降。

1.6 心肌細(xì)胞產(chǎn)量及活性檢測(cè)

1.6.1 計(jì)數(shù)：在倒置顯微鏡下用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)心臟細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞數(shù)/毫升原液=(4個(gè)大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×104×稀釋倍數(shù)。

1.6.2 臺(tái)盼藍(lán)染色：用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，臺(tái)盼藍(lán)拒染的細(xì)胞為活的心肌細(xì)胞，計(jì)算臺(tái)盼藍(lán)染色陰性的桿狀(包括矩形)細(xì)胞占總桿狀細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.6.3 場(chǎng)剌激觀察收縮細(xì)胞比率：將心肌細(xì)胞加入檢測(cè)皿，給予局部場(chǎng)刺激(頻率1 Hz，電壓15 V，脈寬2 ms)，在倒置顯微鏡下計(jì)算收縮細(xì)胞比率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞的形態(tài)及產(chǎn)量

在倒置顯微鏡下觀察，分離即刻的心肌細(xì)胞主要有4種形態(tài)：呈桿狀、矩形、圓形和團(tuán)塊狀。高倍鏡下，桿狀和矩形細(xì)胞橫紋清晰、棱角分明，為存活的心肌細(xì)胞;圓形和團(tuán)塊狀細(xì)胞胞膜皺縮，無(wú)橫紋，為死細(xì)胞或受損細(xì)胞(圖4，封三)。實(shí)驗(yàn)組桿狀(包括矩形)細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P＜0.01;實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞產(chǎn)量也顯著高于對(duì)照組(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P＜0.01。培養(yǎng)48 h后心肌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，由桿狀變成扁平狀，棱角逐漸變得圓鈍(圖5，封三)。

2.2 心肌細(xì)胞活性(表1)

在復(fù)鈣的過(guò)程中部分桿狀和矩形細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性收縮，少部分變圓，實(shí)驗(yàn)組發(fā)生自發(fā)性收縮的細(xì)胞比率及變圓細(xì)胞比率均明顯低于對(duì)照組;被臺(tái)酚藍(lán)染色的細(xì)胞為死亡細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染的細(xì)胞為活的心肌細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組臺(tái)盼藍(lán)染色陰性的桿狀(包括矩形)細(xì)胞比率明顯高于對(duì)照組;局部場(chǎng)刺激可檢測(cè)心肌細(xì)胞的收縮活性，實(shí)驗(yàn)組收縮細(xì)胞比率顯著高 于對(duì)照組。

表1 兩組心肌細(xì)胞活性比較(n=10)Tab.1 Comparison of the viability of cardiomyocytes in the two groups

3 討論

建立穩(wěn)定的心肌細(xì)胞分離方法、獲得高質(zhì)量的心肌細(xì)胞是成熟心室肌細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。目前成年心肌細(xì)胞的分離主要有2種方法，即離體心臟灌注消化法和心肌組織浸泡消化法［4］。離體心臟生物酶灌注消化法分離心肌細(xì)胞效果較好，分離出的成熟心肌細(xì)胞具有活性高、數(shù)量多等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高。

由于心肌細(xì)胞分離過(guò)程復(fù)雜、環(huán)節(jié)較多，傳統(tǒng)的Langendorff裝置不方便消毒滅菌，容易造成分離細(xì)胞的污染。我們將 Langendorff裝置設(shè)計(jì)制作成幾個(gè)可拆卸部分，以方便高溫、高壓消毒，使用前在超凈臺(tái)中進(jìn)行組裝。心肌細(xì)胞分離的所有操作均可在超凈臺(tái)中完成，大大降低了微生物污染的可能性。但是，超凈臺(tái)內(nèi)高度有限，導(dǎo)致灌注壓不足，影響了心肌細(xì)胞分離效果。而且，隨著灌流瓶中液面的下降，灌注壓進(jìn)一步降低，整個(gè)消化過(guò)程中消化液流量極不穩(wěn)定。消化的不同階段對(duì)灌流速度也有明顯影響。開(kāi)始數(shù)分鐘流速較快;消化中期消化液會(huì)變得很黏稠，流速變慢;末期因血管被消化，流速加快。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們觀察到，上述因素引起的灌流不暢明顯影響心肌細(xì)胞分離效果。本研究采用II型膠原酶加壓勻速灌流，每只大鼠心臟的細(xì)胞產(chǎn)量可達(dá)3.6×107，桿狀和矩形細(xì)胞比率達(dá)90%以上，顯著高于對(duì)照組，明顯提高了成熟心肌細(xì)胞的分離效果。

成年大鼠心肌細(xì)胞個(gè)體大而脆弱，消化過(guò)程中的很多因素很容易引起心肌細(xì)胞的損傷，最終影響細(xì)胞的活性［5，6，7］。復(fù)鈣時(shí)出現(xiàn)自發(fā)性收縮及變圓的細(xì)胞為“鈣反?！奔?xì)胞，提示在分離過(guò)程中細(xì)胞膜受到損傷?；钚约?xì)胞的細(xì)胞膜完整，所以臺(tái)盼藍(lán)不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而拒染。死亡或損傷嚴(yán)重的心肌細(xì)胞膜缺乏完整性，被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。本研究實(shí)驗(yàn)組自發(fā)收縮細(xì)胞比率和變圓細(xì)胞比率均明顯低于對(duì)照組，而臺(tái)盼藍(lán)染色陰性細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組，表明Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流可有效減少心肌細(xì)胞損傷。收縮活性是成熟心肌細(xì)胞功能的特征性標(biāo)志。場(chǎng)剌激研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流所獲得的心肌細(xì)胞中收縮細(xì)胞比率顯著高于對(duì)照組，表明實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞的功能活性也得到了較好的保護(hù)。

在心肌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，除了要警惕成纖維細(xì)胞的污染外，還必須關(guān)注心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的存在。內(nèi)皮細(xì)胞在鏡下可成“鋪路石”樣改變，與心肌細(xì)胞大相徑庭，而血管平滑肌細(xì)胞在鏡下成梭狀，但一般不會(huì)發(fā)生心肌細(xì)胞特異性的“搏動(dòng)”現(xiàn)象，可據(jù)此鑒別兩者。心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞往往需要過(guò)度消化才會(huì)出現(xiàn)在培養(yǎng)細(xì)胞中，故如發(fā)現(xiàn)有以上兩者的污染，則應(yīng)縮短消化時(shí)間。另外，心肌細(xì)胞較大，沉降較快，分離的心肌細(xì)胞置于KB液中進(jìn)行反復(fù)沉降，可有效去除細(xì)胞碎片和雜細(xì)胞，得到比較純凈的心肌細(xì)胞。

本研究采用改良Langendorff裝置進(jìn)行Ⅱ型膠原酶加壓勻速灌流，分離成熟心肌細(xì)胞，不但滿足了細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌要求，而且提高了成熟心肌細(xì)胞的分離效率，獲得了高產(chǎn)量、高活性的心肌細(xì)胞，為成熟心肌細(xì)胞培養(yǎng)及研究奠定了基礎(chǔ)。

(本文圖1～5見(jiàn)封三。)

［1］ 王亭忠，席雨濤，吳格如，等.大鼠成體心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)［J］. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26(17)：1154-1156.

［2］ 廖華，糜濤，涂志業(yè)，等.成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法的改良［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(33)：6536-6539.

［3］ Loughrey CM，Seidler T，Miller SL，et al.Over-expression of FK506-binding protein FKBP12.6 alters excitation-contraction coupling in adult rabbit cardiomyocytes［J］.Physiol，2004，556(3)：919-934.

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Pressure perfusion with collagenase typeⅡimproves the efficacy of isolation of adult rat cardiomyocytes

LI De，TANG Bing，YANG Da-chun，MA Shuang-tao，YANG Yong-jian
(Department of Cardiology，Chengdu Military Area Command General Hospital，Chengdu 610083，China)

Objective To explore a more effective method of isolation of adult rat cardiomyocytes.Methods Cardiomyocytes from SD rats were isolated by collagenase type II perfusion in the control group，and by pressure perfusion with collagenase type II in the experimental group.The morphology of cardiomyocytes was observed by optical microscopy and the cardiomyocyte viability was evaluated by trypan blue exclusion test and local field stimulation.Results The ratio of rod-shaped cells and yield of viable cells per rat were significantly higher in the experimental group than that in the control group［(90.3±4.4)% νs.(53.4±5.2)%，P ＜0.01;(3.6±0.7) × 107νs.(1.9±0.6) × 107，P ＜0.01］.During recalcification，the incidence of spontaneous contraction and deformation was significantly lower in the experimental group than that in the control group(10.4±2.1% νs.(18.9±4.5)%，P＜0.01;(5.3±1.3)% νs.(8.6±1.7)%，P＜0.05).The ratio of trypan blue test-negative cells and cells with contractile under local field stimulation were also significantly higher in the experimental group than that in the control group((95.3±8.2)% νs.(90.6±9.8)%，P＜0.05;(92.2±7.6)% νs.(85±6.4)%，P＜0.01).Conclusion Adult rat cardiomyocytes can be isolated more efficiently by collagenase typeⅡpressure perfusion.

Rat;Cardiomyocytes;cell separation

Q95-33，R542.2

A

1005-4847(2011)02-0150-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.014

心肌細(xì)胞已成為研究心肌結(jié)構(gòu)、代謝、功能、病理生理、發(fā)病其機(jī)制及心肌疾病治療的重要工具。分離和培養(yǎng)胚胎期或新生期動(dòng)物心肌細(xì)胞(未成熟心肌細(xì)胞)的實(shí)驗(yàn)方法較為成熟，而成年動(dòng)物心肌細(xì)胞(成熟心肌細(xì)胞)的分離和培養(yǎng)較為困難。未成熟心肌細(xì)胞無(wú)論在功能還是在結(jié)構(gòu)等方面與成熟的心肌細(xì)胞相比均存在差異，因此，來(lái)自于未成熟心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)論難于推論于成熟心肌細(xì)胞，應(yīng)用成熟心肌細(xì)胞進(jìn)行心臟疾病發(fā)病機(jī)制和治療研究成為心血管病領(lǐng)域的重要課題［1］。但由于成熟心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)較困難，技術(shù)條件要求較高，限制了成熟心肌細(xì)胞在心臟疾病研究方面的應(yīng)用。目前，大多數(shù)研究均采用 Langendorff裝置生物酶灌流消化法分離成熟心肌細(xì)胞［2，3］。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)Langendorff裝置不易消毒滅菌，分離效果不穩(wěn)定，活細(xì)胞產(chǎn)量不高。我們對(duì)Langendorff裝置進(jìn)行了改良，并通過(guò)加壓灌流控制流量，經(jīng)長(zhǎng)期摸索，建立了較為穩(wěn)定的成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法。

李德(1966-)，男，副主任醫(yī)師，博士，研究方向：心力衰竭與心律失常。

2010-09-27