賀曉玉，何 君，徐艷峰，秦 超，高 虹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的生理生化常數(shù)

賀曉玉，何 君，徐艷峰，秦 超，高 虹

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 測(cè)定綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠不同年齡段的生理生化、組織病理學(xué)等方面的指標(biāo)，為該品種轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于毒理學(xué)等領(lǐng)域研究提供理論依據(jù)。方法 定期測(cè)定不同周齡段(4～6周齡，6～8周齡，9～12周齡，13～14周齡)141只綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因(GFP)小鼠和100只對(duì)照組C57BL/6J小鼠的體重和攝食量，對(duì)上述兩種動(dòng)物定期取血，測(cè)定血生化及血液學(xué)指標(biāo)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，計(jì)算主要臟器(心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺，性腺)的臟器系數(shù)并進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果 ①體重和攝食量：4周齡的GFP小鼠，其體重明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01);4～5周齡的GFP小鼠，其攝食量明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。②血常規(guī)測(cè)定：6～8周齡，9～12周齡的GFP小鼠，其紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01);9～12周齡，13～14周齡的GFP小鼠，其白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。③血生化測(cè)定：6～8周齡，9～12周齡，13～14周齡的 GFP小鼠，其尿酸(UA)值明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01);6～8周齡，9～12周齡的GFP小鼠，其總蛋白(TP)，白蛋白(ALB)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。④臟器系數(shù)：6～8周齡，9～12周齡的 GFP小鼠，其胸腺的臟器系數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01);9～12周齡，13～14周齡的GFP小鼠，其肝臟的臟器系數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。⑤病理檢測(cè)：6～8周齡有部分GFP小鼠胸腺發(fā)育不良，其他受檢臟器和其他年齡段動(dòng)物未見(jiàn)明顯病理改變。結(jié)論①綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照組C57BL/6J小鼠相比，在體重(4周齡)、攝食量(4～5周齡)、血常規(guī)(紅細(xì)胞計(jì)數(shù)RBC、白細(xì)胞計(jì)數(shù)WBC、血紅蛋白HGB)、血生化(尿酸UA、總蛋白TP、白蛋白ALB)、臟器系數(shù)(胸腺，肝臟)等指標(biāo)上存在明顯差異，但是其值均在正常范圍內(nèi)。②綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠在6～8周齡有部分小鼠胸腺發(fā)育不良。

綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠;血液常規(guī);血液生物化學(xué);病理學(xué)

綠色熒光蛋白具有熒光穩(wěn)定，檢測(cè)方便，對(duì)活細(xì)胞無(wú)傷害等優(yōu)點(diǎn)，已被作為一種標(biāo)記基因應(yīng)用到生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域［1］。本研究所使用的動(dòng)物是將表達(dá)綠色熒光蛋白的基因?qū)胄∈篌w內(nèi)，構(gòu)建成能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)基因小鼠。此種轉(zhuǎn)基因小鼠可以利用光學(xué)成像技術(shù)跟蹤靶細(xì)胞，是研究干細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞的工具小鼠。目前國(guó)內(nèi)外雖然有關(guān)于綠色熒光小鼠生理生化等各個(gè)檢測(cè)指標(biāo)的研究［2-3］，但是還不足以建立一個(gè)針對(duì)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的生理指標(biāo)平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)旨在針對(duì)各不同周齡的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，全面測(cè)定其生理，生化，組織病理學(xué)各指標(biāo)，為新藥安全評(píng)價(jià)工作的深入展開(kāi)提供科學(xué)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(由本所遺傳中心構(gòu)建)

PCR法從 pEGFP-N1質(zhì)粒中擴(kuò)增 EGFP基因，DNA序列分析證實(shí)沒(méi)有突變。把EGFP基因克隆入系統(tǒng)性表達(dá)的chicken β-actin強(qiáng)啟動(dòng)子下游構(gòu)建EGFP轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因載體用SalI線性化調(diào)整濃度至5 ng/μL，用顯微注射法將線性化的轉(zhuǎn)基因載體注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中。構(gòu)建出表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.2 動(dòng)物來(lái)源和飼養(yǎng)環(huán)境

各不同周齡的轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白小鼠共141只【SCXK(京)2009-0004)】，對(duì)照組 C57BL/6J小鼠100只【SCXK(京)2009-0007】。動(dòng)物購(gòu)自：北京華阜康生物科技股份有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，日常喂以60Co照射的維持飼料。

1.3 儀器與試劑

日本日立7020全自動(dòng)生化測(cè)定儀，德國(guó)Beckman全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀，日本櫻花推拉式切片機(jī)(IVS-410)，德國(guó)徠卡石蠟包埋機(jī)(EG1150H+C)，德國(guó)徠卡全自動(dòng)組織脫水機(jī)(ASP300)。

1.4 方法

1.4.1 體重和攝食量：每日觀察動(dòng)物，每周1次測(cè)定GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和其對(duì)照動(dòng)物C57BL/6J小鼠的體重和攝食量。

1.4.2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)指標(biāo)：各周齡小鼠分批眼眶采血0.2 mL，EDTA-K3抗凝，全自動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、白細(xì)胞計(jì)數(shù) (WBC)及其分類，血小板計(jì)數(shù)(PLT)等9項(xiàng)。

1.4.3 血生化指標(biāo)：各周齡小鼠分批眼眶取血0.3 mL，取血清在全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)包括丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、球蛋白(GLO)，白蛋白/球蛋白(A/G)。

1.4.4 大體解剖：取動(dòng)物腦、心臟、肝、脾、肺、胸腺、腎、性腺(雄性動(dòng)物睪丸和附睪;雌性動(dòng)物子宮和卵巢)，臟器稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。并將上述臟器用4%甲醛固定，進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)。

1.4.5 數(shù)據(jù)處理：采用 Excel統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算并進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同周齡GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組C57BL/6J小鼠體重

GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57BL/6J小鼠的體重隨周齡的增加呈上升趨勢(shì)。4周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠體重明顯低于同周齡的 C57BL/6J小鼠，差異具有顯著性(P＜0.01)。但在5～11周齡，GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與同周齡的C57BL/6J小鼠相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表 1)。

2.2 不同周齡GFP轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組C57BL/6J小鼠攝食量

4～5周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠攝食量明顯高于同周齡的C57BL/6J小鼠，差異具有顯著性(P＜0.01)。6～11周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠其攝食量與同周齡的C57BL/6J小鼠相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表2)。

表1 各周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的體重統(tǒng)計(jì)(s，g)Tab.1The body weight of different week-old of GFP mice and C57 BL/6J mices，g)

表1 各周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的體重統(tǒng)計(jì)(s，g)Tab.1The body weight of different week-old of GFP mice and C57 BL/6J mices，g)

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note： There are 37 mice in the experimental group and 100 mice in the control group.Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

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表2 各周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的攝食重統(tǒng)計(jì)(s，g)Tab.2The food intake of different week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(s，g)

表2 各周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的攝食重統(tǒng)計(jì)(s，g)Tab.2The food intake of different week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(s，g)

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note： There are 37 mice in the experimental group and 100 mice in the control group.Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

?

2.3 不同周齡段GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)

6～8周齡和9～12周齡的GFP小鼠，其紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。9～12周齡，13～14周齡的 GFP小鼠，其白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。6～8周齡的 GFP小鼠，其血紅蛋白(HGB)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性 (P＜0.01)。6～8周齡的 GFP小鼠，其血小板(PLT)計(jì)數(shù)高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)(表3)。

表3 不同周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的血常規(guī)指標(biāo)Tab.3 Blood routine examination of the 6-8，9-12，and 13-14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

2.4 不同周齡GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的血生化各項(xiàng)指標(biāo)

6～8周齡，9～12周齡，13～14周齡的 GFP小鼠，其尿酸(UA)值明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。6～8周齡和9～12周齡的 GFP小鼠，其總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。9～12周齡和13～14周齡的 GFP小鼠，其 A/G值明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)。6～8周齡的 GFP小鼠其甘油三酯(TG)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)，其球蛋白(GLO)，尿素氮(BUN)低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。9～12周齡的GFP小鼠其丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)值明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)，其乳酸脫氫酶(LDH)血糖(GLU)尿素氮(BUN)高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。13～14周齡的尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)值明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)，其白蛋白(ALB)低于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.05)。其他檢測(cè)指標(biāo)GFP小鼠與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表4)。

表4 不同周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的血生化指標(biāo)(s)Tab.4 The values of blood biochemistry of 6～8，9～12，13～14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

表4 不同周齡的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的血生化指標(biāo)(s)Tab.4 The values of blood biochemistry of 6～8，9～12，13～14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

注：各組與其相應(yīng)的對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01Note： Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

?

2.5 不同周齡GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的臟器系數(shù)

6～8周齡和9～12周齡的GFP小鼠，其胸腺的臟器系數(shù)明顯低于對(duì)照組，差異具有顯著性，(P＜0.01);9～12周齡和13～14周齡的GFP小鼠，其肝臟的臟器系數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異具有顯著性(P＜0.01)(表5)。

2.6 病理檢測(cè)結(jié)果

將上述各不同周齡的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因GFP小鼠和C57 BL/6J小鼠的各受檢臟器進(jìn)行組形態(tài)學(xué)觀察。6～8周齡有部分綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺發(fā)育不良，9周齡以上的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠各受檢臟器未見(jiàn)明顯病理改變。各周齡的C57 BL/6J小鼠各受檢臟器未見(jiàn)明顯病理改變(見(jiàn)圖1，彩插2)。

3 討論

小鼠廣泛用于藥物篩選、生物制品檢定、藥品的毒性試驗(yàn)及三致(致畸，致癌，致突變)試驗(yàn)［4］。熒光成像具有操作簡(jiǎn)單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點(diǎn)，在活體動(dòng)物體內(nèi)成像中可得到廣泛應(yīng)用［5-8］。而對(duì)于宏觀的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)來(lái)講，其最大的優(yōu)點(diǎn)在于可以不必剖殺即可活體進(jìn)行檢測(cè)，這大大減少了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量，能極大地縮短毒性評(píng)價(jià)時(shí)間。因此可將此綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于毒理學(xué)各個(gè)方面，如致癌試驗(yàn)、致畸試驗(yàn)等。

表5 不同周齡的綠色熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)基因小鼠與C57 BL/6J小鼠的臟器系數(shù)(單位：%)Tab.5 Organ coefficient of the 6-8，9-12，13-14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(unit： %)

本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組。雖然綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠是在C57BL/6J小鼠的基礎(chǔ)上構(gòu)建成功的，但在生理、生化等指標(biāo)上確實(shí)存在差異，但是其值均在在正常范圍內(nèi)。這與田小蕓［2］等所得出的結(jié)論部分一致。

臟器系數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，部分GFP小鼠的肝臟器系數(shù)與其對(duì)照組相比，有顯著性差異。但是經(jīng)病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝臟并無(wú)異常，因此認(rèn)為此差異并非病變，而是生理性差異所致。部分小鼠的胸腺臟器系數(shù)與對(duì)照組相比，有顯著性差異，經(jīng)病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，此部分小鼠確有胸腺發(fā)育不良狀況。

病理檢測(cè)提示轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白小鼠部分胸腺發(fā)育缺陷。推測(cè)可能是綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因植入C57BL/6J小鼠體內(nèi)，引起動(dòng)物的發(fā)育遲緩所致。所以不排除外源GFP基因?qū)π∈蟀l(fā)育存在一定毒性的可能。

在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育早期，綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照組動(dòng)物C57BL/6J小鼠比較，體重和攝食量明顯降低，可能的原因是小鼠本身體質(zhì)差異所致。本實(shí)驗(yàn)所用小鼠數(shù)量多，周齡范圍廣，對(duì)綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了攝食、體重、血常規(guī)、血生化、病理等方面的檢測(cè)，積累了各個(gè)周齡小鼠的豐富的生理生化數(shù)據(jù)，為轉(zhuǎn)基因綠色熒光蛋白小鼠的深入研究建立了系統(tǒng)化的資料庫(kù)。

(本文圖1見(jiàn)彩插2。)

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Physiological and biochemical indexes of the green fluorescent protein-transgenic mice

HE Xiao-yu，HE Jun，XU Yan-feng，QIN-Chao，GAO-Hong*
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To establish a database of the physiological，biochemical and pathological indexes of the green fluorescent protein(GFP)transgenic mice and provide theoretical evidence for toxicological and other studies.Methods Two hundred and forty one GFP mice and 100 C57BL/6J mice were included in this study.These mice were of 4-6-week-old，6-8-week-old，9-12-week-old，and 13-14-week-old.The body weight and food intake of the mice were recorded regularly.The blood routine examination was performed and blood biochemical parameters were determined.The weight of organs(heart，liver，brain，lung，spleen，kidney，thymus，sex glands)were measured and their organ coefficients werecalculated.The organs were examined by histology as well.Results 1.Body weight： For the 4-week-old GFP mice，the body weight was lower than that of the control group，with a significant difference(P＜0.01).For the 4-5-week-old GFP mice，their food intake was higher than that of the control group，with a significant difference(P＜0.01).2.Blood routine examination： For the 6-8 and 9-12-week-old mice，the index RBC in the GFP mice were lower than that of the C57BL/6J mice with a significant difference(P ＜0.01).For the 9-12 and 13-14-week-old mice，the WBC in the GFP mice was higher than that in the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜0.01).3.Blood biochemistry： For the 6-8，9-12，and 13-14-week-old mice，the index UA of the GFP mice was higher than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P＜0.01).For the 6-8，9-12-week-old mice，the indexes TP and ALB of the GFP mice was lower than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜ 0.01).4.Organ coefficient： For the 6-8，9-12-week-old mice，the thymus organ coefficient of GFP mice was lower than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P＜0.01).For the 9-12，13-14-week-old mice，the liver organ coefficient of GFP mice was higher than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜0.01).5.Pathology： There was thymus dysplasia in some of the 6-8-week-old GFP mice.While the rest of GFP mice and the mice of the control group were normal.Conclusions There were some physiological differences between the GFP mice and C57BL/6J mice such as body weight(4-week-old mice)，food-intake(4-5-week-old mice)，blood routine examination(WBC，RBC，HGB)，blood-biochemistry(UA，TP，ALB)，and organ coefficient(thymus，liver).There were no pathological changes in the GFP mice，except of thymus dysplasia in some of 6-8-week-old mice.

Green fluorescent protein transgenic mice;Blood routine examination;Blood biochemistry;Pathology

Q95-33，R349.83

A

1005-4847(2011)02-0145-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.013

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)課題(2008ZX09305-001)。

賀曉玉(1985-)，女，碩士研究生，E-mail：hxywxl2007@126.com

高虹(1968-)，女，E-mail：gaohongdws@yahoo.com.cn

2010-09-27